循環(huán)酶法雙試劑測定血清同型半胱氨酸的方法學(xué)評價

焦文學(xué)，王 潔（甘肅省隴南市第一人民醫(yī)院檢驗科 453000）

近年來研究表明，同型半胱氨酸（Hcy）與冠心病、腦卒中、彌漫性腦動脈硬化、糖尿病腎病等疾病關(guān)系甚為密切［1-2］。最早檢測Hcy是氨基酸分析法，Ueland等測定血清中Hcy，后經(jīng)改良，目前常用方法為高效液相色譜法（HPLC）、熒光偏振免疫檢測法（FPIA）和酶免疫分析法（EIA）。HPLC是經(jīng)典的參考方法，其操作比較復(fù)雜、試驗耗時比較長、試驗數(shù)據(jù)變異比較大，在臨床應(yīng)用方面逐漸被FPIA和EIA所取代。但FPIA存在價格昂貴的缺點，EIA存在大部分操作還是手工操作，比較耗時等缺點［3］，所以兩種方法不適用于各級實驗室，尤其是基層醫(yī)療單位的推廣。近年來，由于Hcy檢測技術(shù)的發(fā)展，對其研究逐漸深入，循環(huán)酶法因為具有快速、簡便、靈敏度高，易于自動化等特點，逐漸成為適用于各級實驗室的常規(guī)檢測方法。本文對循環(huán)酶法雙試劑測定血清Hcy進(jìn)行了方法學(xué)評價。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2010年1月至2011年11月本院門診和住院的患者97例，其中男52例，女45例，年齡31～86歲，平均（41.7±10.3）歲。

1.2 儀器與試劑 日立7180型全自動生化分析儀。Hcy檢測試劑（浙江伊利康生物技術(shù)有限公司）包括試劑Ⅰ：腺苷甲硫氨酸（濃度為0.1mmol／L）、三（2－羧乙基）磷氯化氫（濃度為0.5mmol／L）、谷氨酸脫氫酶（20 k U／L）；試劑Ⅱ：Hcy水解酶（3.0 k U／L）、Hcy基轉(zhuǎn)移酶（3.0 k U／L）；2個水平的 Hcy標(biāo)準(zhǔn)液（分別為0.0和28.0μmol／L）。

1.3 測定原理 樣品中的氧化型Hcy被還原劑還原成游離型Hcy，游離型Hcy與試劑中的底物和酶發(fā)生反應(yīng)引起吸光度變化，通過檢測反應(yīng)中的吸光度變化的速率，可以計算出待測樣本中Hcy的濃度。

1.4 測定方法 生化分析儀基本參數(shù)設(shè)置：反應(yīng)類型為速率A法；波長340 nm（主）／405 nm（副）；37℃反應(yīng)10min，讀數(shù)時間23～31點，樣品量8μL，R1量125μL，R2量25μL。

1.5 方法學(xué)評價指標(biāo) 進(jìn)行方法的回收試驗、干擾試驗，精密度、線性范圍及方法對比試驗。

1.5.1 精密度評價 按照 NCCLS（EP5－T2）文件的評價方案，取濃度為12.0和28.0μmol／L的 Hcy質(zhì)控品各一份，用循環(huán)酶法將此兩份標(biāo)本每天上午、下午雙份測定，連續(xù)20 d。

1.5.2 回收試驗 向500μL血清中加入50μL的生理鹽水作為基礎(chǔ)樣本，測得Hcy濃度為8.5μmol／L，向同體積的血清標(biāo)本中分別加入50μL的濃度為50.0和200.0μmol／L的Hcy純品，使其終濃度分別為12.3和25.9μmol／L，每一濃度作平行管。

1.5.3 線性試驗 取高值樣本用蒸餾水稀釋成5個不同濃度的樣本，每個樣本重復(fù)測定3次，計算出回歸方程Y＝a＋b X及線性誤差（相關(guān)系數(shù)）r2。

1.5.4 干擾試驗 以濃度為12.3μmol／L的 Hcy為基礎(chǔ)血清，加入不同濃度的干擾物，同時對相同體積的蒸餾水作為基礎(chǔ)樣品，同時進(jìn)行測定，計算加入干擾物質(zhì)后的測定結(jié)果與基礎(chǔ)樣本的測定結(jié)果之間的偏差。

1.5.5 方法比較 選擇 Hcy濃度在5.2～65μmol／L的臨床血清標(biāo)本30份，分別用本法（Y）和酶免疫分析法（X）測定，每份樣品作雙份測定，結(jié)果取均值。

1.5.6 參考值范圍測定 選用150名體檢結(jié)果正常、肝腎功能試驗等各項理化指標(biāo)正常的門診體檢者的空腹血清標(biāo)本，年齡在17～63歲之間，其中，男92例，女58例。

2 結(jié) 果

2.1 精密度及回收率 結(jié)果批內(nèi)CV分別為2.85%、1.88%；日間 CV 分別 為4.26%、3.19%，總 CV 分別 為6.35%、5.33%。測得其回收率為93.5%～97.7%。

2.2 線性試驗及干擾試驗 線性相關(guān)方程Y＝0.982 1 X＋0.054 7，r2＝0.999 6。干擾試驗結(jié)果表明，三酰甘油濃度小于或等于10mmol／L，血紅蛋白濃度小于或等于4.5 g／L，維生素C濃度小于或等于500 mg／L，膽紅素濃度小于或等于300 μmol／L時，血氨小于或等于70μmol／L時，偏差均小于5.0%，說明上述濃度的物質(zhì)無明顯干擾。

2.3 與ELA比較 本法和ELA比較，Y＝1.040 0 X－0.549 8，r2＝0.995 9，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 參考值范圍測定 Hcy結(jié)果的頻數(shù)分布均為非正態(tài)性分布，男女之間結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。取95%置信區(qū)間確定的參考范圍為：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L。

3 討 論

Hcy是人體內(nèi)含硫氨基酸的一個重要的代謝中間產(chǎn)物、可能是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的一個獨立危險因子。血漿中Hcy含量與遺傳因素、營養(yǎng)因素、雌激素水平、年齡因素等有關(guān)，與Hcy代謝有關(guān)的N5N10－亞甲基四氫葉酸還原酶和胱硫醚－β－合成酶的基因突變，酶活性下降，也可引起高Hcy血癥［5］。血清Hcy濃度測定近年來受到廣泛重視，本試驗所應(yīng)用的酶速率法測定血清Hcy反應(yīng)原理基于小分子捕獲技術(shù)SMT的S－腺苷Hcy水解酶在TCEP作用下［5］，氧化型Hcy轉(zhuǎn)化為游離型 Hcy，游離型Hcy與共價底物S－腺苷甲硫氨酸（SAM）催化反應(yīng)形成甲硫氨酸與S－腺苷同型半胱氨酸（SAH）。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循環(huán)加入反應(yīng)，從而放大了檢測信號。本研究取95%置信區(qū)間確定的參考范圍為：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L，與文獻(xiàn)［6］有一定差距。為利用酶促反應(yīng)及還原性輔酶Ⅰ的變化來測定血清Hcy的一種嶄新的化學(xué)性方法，做到從免疫到化學(xué)的過渡，本法與之前所使用的循環(huán)酶法比較，以前是采用三試劑，而現(xiàn)在采用的是雙試劑，更適合在多種自動化分析儀上測定，靈敏度高，線性范圍寬，抗干擾因素強(qiáng)，精密度較好，值得各級醫(yī)院推廣使用。

［1］顧炳權(quán)，王多寧.血漿同型半胱氨酸水平及臨床診斷意義［J］.中國血液流變學(xué)雜志，2004，14（4）：630－634.

［2］肖飛，郭健.血液中同型半胱氨酸的檢測及意義［J］.臨床檢驗雜志，2000，18（1）：56－57.

［3］呂偉標(biāo)，羅玲.檢測同型半胱氨酸的方法學(xué)進(jìn)展和評價［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，7（7）：175－176.

［4］胡紅巖，劉建剛，崔云龍，等.血液同型半胱氨酸的測定方法及臨床意義［J］.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，1999，20（6）：254－255.

［5］Roberts RF，Roberts WL.Performance characteristics of a recombinant enzymatic cycling assay for quantification of total homocysteine in serum or plasma［J］.Clin Chim Acta，2004，344（1－2）：95－99.

［6］Malinow MR，Bostom AG，Krauss RM.Homocyst（e）ine，diet，and cardiovascular diseases：a statement for healthcare professionals from the Nutrition Committee，American Heart Association［J］.Circulation，1999，99（1）：178－182.