高效和超高效液相色譜法測(cè)定樂脈丸中丹酚酸B含量的比較

王 慧，況 剛，封海霞，徐小利，袁祥慧，鄧開英

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 400015)

樂脈丸由丹參、川芎、赤芍、紅花、香附、木香、山楂等中藥組方，具有行氣活血、化瘀通脈的功效。筆者分別采用超高效液相色譜(UPIC)法和高效液相色譜(HPLC)法對(duì)樂脈丸中丹酚酸B進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，旨在為樂脈丸質(zhì)量控制提供新方法。

1 儀器與試藥

Waters Acqui－UPLC超高效液相色譜儀;島津2010型高效液相色譜儀。樂脈丸(批號(hào)分別為 110101，110201，110202，康美保寧(四川)制藥有限公司);丹酚酸B對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111562－201110，供含量測(cè)定用);甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 HPLC 法[1]

2．1．1 色譜條件

色譜柱:迪馬 C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －乙腈 －17%甲酸(27∶4∶69);流速:1．0 mL/min;檢測(cè)波長:286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2．1．2 溶液制備

取本品裝量差異項(xiàng)下的包衣小丸適量，研細(xì)，取約0．3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0．1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):取按處方比例及制法制備缺丹參陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液，并依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照品溶液無干擾(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取質(zhì)量濃度為0．100 548 g/L的丹酚酸 B 對(duì)照品溶液 2，5，10，15，20，25 μL，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得方程為Y=1 157 993X+823．9，r=0．999 5(n=6)。結(jié)果表明，丹酚酸 B 進(jìn)樣量在 0．201 10 ～2．513 70 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL。結(jié)果的RSD=0．2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)樣品，按依法分別制備6份供試品溶液并測(cè)定丹酚酸B含量。結(jié)果的RSD=1．0%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10 h 時(shí)進(jìn)樣5 μL，測(cè)定丹酚酸B的峰面積。結(jié)果的RSD=0．4%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號(hào)為110101，含量為16．94 mg/g)6份各約 0．15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份精密加入丹酚酸B對(duì)照品2．026 64 mg，按供試品溶液制備方法操作，測(cè)定丹酚酸B的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為97．9% ，RSD為 0．4%(n=6)。

2．1．4 樣品含量測(cè)定

取本品3批(批號(hào)分別為110101，110201，110202)，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算供試品中丹酚酸B的含量，結(jié)果分別為 16．94，12．06，6．84 mg/g。

2．2 UPLC 法

2．2．1 色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm ×2．1 mm，1．7 μm);流動(dòng)相:甲醇－乙腈－17%甲酸(20∶1∶79);流速:0．6 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;檢測(cè)波長:286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。在此條件下，色譜圖見圖2。

圖2 超高效液相色譜圖

2．2．2 溶液制備

同2．1．2項(xiàng)下方法制備。

2．2．3 樣品含量測(cè)定

取本品 3批(批號(hào)分別為 110101，110201，110202)，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算供試品中丹酚酸B的含量，結(jié)果分別為 16．93，12．06，6．84 mg/g。

3 討論

在HPLC法的基礎(chǔ)上，考察了UPLC法不同比例的甲醇－乙腈－17%甲酸系統(tǒng)，結(jié)果表明，將甲醇－乙腈－17%甲酸(27∶4∶69)調(diào)整為甲醇－乙腈－17%甲酸(20∶1∶79)時(shí)，分離度及峰形均較好。本試驗(yàn)比較了UPLC法與HPLC兩種方法的檢測(cè)條件和檢測(cè)結(jié)果，HPLC流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，主峰出峰時(shí)間為45 min，分析檢測(cè)時(shí)間為55 min;UPLC流速為0．6 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，出峰時(shí)間約為1 min，樣品檢測(cè)時(shí)間2 min內(nèi)完成。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無明顯差異。將HPLC定量方法轉(zhuǎn)換并優(yōu)化為UPLC方法，在保證含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，提高了色譜峰的分離度，節(jié)省了分析時(shí)問，減少了溶劑損耗及廢液處置費(fèi)用，提高了分析效率。

[1]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:70－71．