基因工程HBsAg純化技術(shù)的研究進(jìn)展

潘太健 ，馬 瑞 ，曹春來(lái) ，彭 韙 ，孫萬(wàn)邦 ，肖擁軍

(1.珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司生物研究所，廣東 珠海 519041; 2.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)·貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，廣東 珠海 519041)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)存在3種顆粒形式，分別是Dane顆粒、絲狀顆粒和球形顆粒[1]。病毒包膜有S蛋白、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白3種表面抗原蛋白，分別構(gòu)成了大蛋白(L，Pre-S1+Pre-S2+S)、中蛋白(M，Pre-S2+S)和主蛋白(S)3種形式[2]，因Pre-S1和Pre-S2易被宿主蛋白酶降解，通?；蚬こ躺a(chǎn)的乙肝疫苗產(chǎn)品主要成分是由約100個(gè)S蛋白、糖和脂組成直徑約22 nm的球形病毒樣顆粒(virus-like Particles，VLPs)，S蛋白病毒樣顆粒的免疫原性是S蛋白單體1000倍以上[3]，HBsAg結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在純化過(guò)程中會(huì)受到諸多因素的影響而遭到破壞，免疫原性也隨之降低，整個(gè)純化過(guò)程的收率只有30%左右。因此，保持HBsAg結(jié)構(gòu)的完整性和理化性質(zhì)的穩(wěn)定性是提高收率的關(guān)鍵。在此根據(jù)HBsAg的結(jié)構(gòu)大小、相對(duì)分子質(zhì)量、帶電性質(zhì)、疏水性、吸附特性、密度等性質(zhì)總結(jié)了HBsAg在純化的3個(gè)階段采用的主流純化技術(shù)。

1 蛋白捕獲階段

1．1 等電點(diǎn)沉淀

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分子間作用力減弱，顆粒碰撞凝聚而形成沉淀物，可以利用該性質(zhì)進(jìn)行蛋白初步分離。Hardy等[4]在大規(guī)模生產(chǎn)HBsAg時(shí)，將破碎液的pH從8調(diào)到4.5，目的蛋白和等電點(diǎn)在4.5左右的雜蛋白及非蛋白脂類被沉下來(lái)，除去了溶解于此環(huán)境的其他雜蛋白，起到了初步分離的作用。

1．2 微濾

微濾是一項(xiàng)根據(jù)不同物質(zhì)間顆粒大小的差異進(jìn)行分離的技術(shù)，根據(jù)蛋白顆粒大小選擇適合膜孔徑的濾膜和壓力進(jìn)行篩分或截留。2007 年，Ottone 等[5]運(yùn)用了 0.2 μm 微濾膜除去大量雜蛋白，結(jié)合截留相對(duì)分子質(zhì)量為300×103或500×103的超濾膜包進(jìn)行超濾濃縮目的蛋白。這種三明治式的純化方法是非常有效的，在更換緩沖液的同時(shí)使得蛋白濃縮了5倍，60%的雜蛋白被除去。這也是默克公司的特色純化技術(shù)。

1．3 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀法可用于從大量破碎液中濃縮和沉淀樣品，初步分離蛋白質(zhì)。Liu等[6]使用20% ～40%飽和度的硫酸銨沉淀畢赤酵母表達(dá)的含有HBsAg破碎液30 min，12 500 g離心15 min后，很明顯地清除了雜蛋白。但Yuan等[7]考察漢遜酵母表達(dá)的HBsAg時(shí)，硫酸銨對(duì)HBsAg卻有較大的影響，硫酸銨濃度為0.4 mol/L時(shí)，會(huì)引起HBsAg聚集，隨著濃度增加，聚集現(xiàn)象更加嚴(yán)重，這會(huì)改變HBsAg的結(jié)構(gòu)，從而影響其生物活性。可以看出，不同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的HBsAg結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有所差異，要對(duì)特定的HBsAg的性質(zhì)進(jìn)行個(gè)性研究。

1．4 聚乙二醇(PEG)沉淀

PEG沉淀是利用空間位阻破壞生物大分子的水化膜來(lái)進(jìn)行蛋白沉淀的一項(xiàng)技術(shù)。張焱等[8]在運(yùn)用PEG沉淀HBsAg時(shí)，對(duì)PEG相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)量濃度、鹽濃度、pH、溫度進(jìn)行了正交試驗(yàn)，優(yōu)化了工藝，最終采用了 PEG6000，質(zhì)量濃度為0.12 g/L，pH=9.0，溫度為4℃的技術(shù)參數(shù)，保證了樣品澄清，且單步收率高達(dá)96.8%。

1．5 硅膠吸附

盡管硅膠吸附的機(jī)制各家說(shuō)法各異，但其對(duì)于HBsAg純化具有以下優(yōu)點(diǎn):選擇性除去HBsAg形式(單體，二聚體)，吸附成熟二硫鍵結(jié)合的病毒樣顆粒;通過(guò)調(diào)整緩沖液和洗脫液的pH可成功吸附和解吸HBsAg，pH是硅膠吸附中的關(guān)鍵參數(shù)。Agraz等[9]運(yùn)用了Hyflo Super Cell，這是一種非特異性吸附硅膠，能使HBsAg顆粒和雜蛋白被吸附到Hyflo Super Cell上，調(diào)整洗脫液的pH到8.0～8.25，HBsAg顆粒被解吸下來(lái)。

2 蛋白中度純化階段

2．1 離子交換層析

在重組HBsAg分離純化應(yīng)用中，研究者多運(yùn)用了DEAE陰離子交換柱，但與疏水層析、分子篩過(guò)濾聯(lián)合后，總收率卻低于30%，大部分損失在離子交換層析中，故離子交換層析是HBsAg純化工藝的瓶頸步驟[10]。研究人員已采用各種策略來(lái)優(yōu)化該步驟，發(fā)現(xiàn)了PEG具有良好的鏈狀柔順性，以其作為保護(hù)劑，能保護(hù)二硫鍵，促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和單體組裝，使得顆粒更均一，接近天然抗原。Zhou等[11]對(duì)PEG流動(dòng)相中的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行了對(duì)比研究，在流動(dòng)相中加入1%PEG10000，結(jié)果收率和純化程度明顯改善，分離效果良好。

2．2 疏水作用層析

疏水層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)和介質(zhì)基團(tuán)間的相互作用力不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的，根據(jù)高鹽上樣，低鹽洗脫的原理，蛋白質(zhì)活性回收率高。HBsAg是一種疏水性很強(qiáng)的脂蛋白，在流動(dòng)相加入乙醇或異丙醇才能洗脫出來(lái)，Liu等[6]將樣品經(jīng)苯基疏水填料上樣后，鹽濃度從8.5%減小到0%進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果均沒(méi)有將目的蛋白洗脫下來(lái)，最后還是在含有10%乙醇的磷酸鹽緩沖液中洗脫出來(lái)，除去了超過(guò)90%的雜蛋白，回收率達(dá)到81.3%。

2．3 超濾

一般超濾技術(shù)在蛋白純化中起濃縮和脫鹽的作用。在HBsAg超濾中，影響蛋白聚集的因素主要是蛋白濃度、相對(duì)分子質(zhì)量和膜孔徑大小，電泳結(jié)果卻顯示回流液中只能收到70%～80%的活性HBsAg，說(shuō)明在超濾過(guò)程中HBsAg部分失活，其原因?yàn)镠BsAg中α-螺旋的降低和γ-轉(zhuǎn)角的升高引起了蛋白的聚集和變性。2006年，Li等[12]運(yùn)用高效色譜和在線多角度散色儀掃描研究了漢遜酵母HBsAg在超濾前后結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)超濾過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，有較多的高聚物產(chǎn)生，蛋白聚集的原因?yàn)樽冃缘鞍组g的部分位點(diǎn)分子間產(chǎn)生連接。針對(duì)這一原因，研究人員在超濾中加入保護(hù)劑，提高了活性蛋白收率。

2．4 免疫親和層析

免疫親和層析是利用HBsAg和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)來(lái)純化蛋白，S蛋白121～137位的α抗原決定族中121～124位對(duì)抗原表位的識(shí)別最關(guān)鍵，在HBsAg純化過(guò)程中，很多宿主蛋白伴隨HBsAg，干擾了其與抗原結(jié)合。為了解決此問(wèn)題，Leyva等[13]在樣品中加入0.1%脫氧膽酸鈉(NaDoc)，結(jié)果其結(jié)合效率比沒(méi)有處理的樣品提高了1.5倍，NaDoc的應(yīng)用提高了抗原抗體識(shí)別能力。Gómez等[14]將 CB-HEP1 anti-HBsAg 用溴化氰(CNBr)法偶聯(lián)在Sepharose CL-4B上進(jìn)行免疫層析來(lái)純化從硅藻土中解吸下來(lái)的HBsAg，并對(duì)抗體的偶聯(lián)密度進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果工藝優(yōu)化后，得出最佳單抗偶聯(lián)密度為3.2 mg MAb/mL。

2．5 硫酸酯纖維素親和層析

硫酸酯纖維素是近年來(lái)應(yīng)用比較熱門的一種親和填料，哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的病毒包膜上的糖基和硫酸酯纖維素表現(xiàn)出很好的親和性，其用于純化HIN5病毒同樣取得很好的分離效果[15]。Jung等[16]在研究HBsAg的L蛋白顆粒時(shí)，因?yàn)镻re的60～61位和139～140位易被降解，在進(jìn)行硫酸酯纖維素親和層析之前，對(duì)樣品進(jìn)行了37℃保溫16 h以上的熱處理，這樣可以減少目的蛋白的降解，硫酸酯纖維素層析前的熱處理運(yùn)用到HBsAg的S蛋白顆粒純化中也可能取得良好純化效果。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)熱處理可以促進(jìn)HBsAg顆粒的成熟，將抗原性提高2～3倍。

3 蛋白精純階段

凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，各個(gè)組分按相對(duì)分子質(zhì)量的大小從大到小依次流出，從而達(dá)到分離的目的，凝膠過(guò)濾層析經(jīng)常用于HBsAg的精純中，可以去除HBsAg聚集體和突變體。Nirmala[18]在純化工藝的最后運(yùn)用了兩步凝膠層析，為了使第2次凝膠精純樣品更均一，在第1次凝膠分子篩得到的樣品中加入胰蛋白酶，37℃保溫處理5 h，結(jié)果第2次凝膠層析得到的樣品顆粒大小更均一。

4 展望

隨著純化新方法和新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，HBsAg的純化也在不斷進(jìn)步，雖然HBsAg純化技術(shù)不斷成熟，但是還面臨以下問(wèn)題:HBsAg的顆粒結(jié)構(gòu)在純化中不均一、穩(wěn)定，導(dǎo)致HBsAg聚集體和突變體的產(chǎn)生;酵母細(xì)胞表達(dá)的HBsAg總收率低，在30%左右，主要原因在于離子交換層析是其純化的瓶頸;純化收率低，生產(chǎn)成本高，限制了在發(fā)展中國(guó)家的廣泛應(yīng)用。研究者正在尋找經(jīng)濟(jì)有效的方法和技術(shù)來(lái)解決這些問(wèn)題，提高產(chǎn)量，降低成本。

目前，沒(méi)有一個(gè)通用的純化模式來(lái)分離純化不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的HBsAg，因此在工作中，針對(duì)特定的HBsAg選擇適合自身的純化流程是最關(guān)鍵的。這需要研究HBsAg自身的各種性質(zhì)，來(lái)選擇適合特定HBsAg的純化工藝。相信隨著純化技術(shù)的不斷更新和工藝的不斷改進(jìn)，會(huì)得到更高純度和收率的HBsAg。

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