骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能異常在雌激素所致骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用研究

廖 立，楊小紅，金 巖

骨質(zhì)疏松是最常見(jiàn)的三大老年性疾病之一，嚴(yán)重危害老年人群的身體健康。其發(fā)病機(jī)制不一，包括遺傳性、廢用性、代謝異常、退行性、激素水平異常、藥物因素等［1］，其中，絕經(jīng)后雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松在其中占據(jù)了很大一部分，＞50歲女性因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折的風(fēng)險(xiǎn)＞20%［2］。相關(guān)的機(jī)制研究過(guò)去主要集中于破骨細(xì)胞的異?；罨?，大量研究表明，雌激素缺乏可以通過(guò)核因子活化因子受體及其配體(RANKL/RANK)途徑刺激破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［3－4］;還能夠直接導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子配體(FasL)表達(dá)下降，使破骨細(xì)胞凋亡下降，延長(zhǎng)存活時(shí)間［5］。但是，近年來(lái)不少學(xué)者提出，骨改建是一個(gè)成骨與破骨動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，成骨及破骨的失衡才是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因［6］。干細(xì)胞作為各種組織細(xì)胞的來(lái)源，在維持組織的新陳代謝和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用，越來(lái)越多的研究提出，干細(xì)胞功能障礙與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，特別是衰老等退行性變中作用明顯［7］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，其在骨骼發(fā)育與重建的過(guò)程中的作用逐漸受到重視。研究發(fā)現(xiàn)［8－9］，BMMSC成骨和成脂分化的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松或者骨量過(guò)高;二聚糖基因(Biglycan)敲除導(dǎo)致小鼠成骨祖細(xì)胞凋亡增加和增殖減弱，導(dǎo)致進(jìn)行性的骨質(zhì)疏松［10］;細(xì)胞凋亡蛋白酶3(caspase3)抑制劑能夠通過(guò)影響B(tài)MMSC的分化而加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生過(guò)程［11］;活化的T細(xì)胞可以通過(guò)凋亡相關(guān)因子及其配體(Fas/FasL)通路導(dǎo)致BMMSC的凋亡而促進(jìn)骨質(zhì)疏松［12］;老年人群的BMMSC的增殖及分化功能均有減退，與骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)相一致［13］。這些實(shí)驗(yàn)證明了BMMSC功能和數(shù)量的異常將導(dǎo)致骨骼發(fā)育和骨改建的異常。但是對(duì)于雌激素缺乏如何導(dǎo)致BMMSC的功能失調(diào)仍尚不明確。在本研究中，我們通過(guò)建立去勢(shì)小鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，提取BMMSC進(jìn)行體外培養(yǎng)和功能檢測(cè)，明確其內(nèi)源性的增殖及分化功能改變，并采用檢測(cè)關(guān)鍵基因表達(dá)水平和microRNA表達(dá)譜分析，從分子水平探索其生物學(xué)行為變化的原因。

材料與方法

1 卵巢切除組(OVX)小鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

取8周齡C57小鼠40只，隨機(jī)分為OVX組和假手術(shù)組(Sham)組，每組20只。OVX組以1%戊巴比妥鈉麻醉后，從背部開(kāi)口尋找到雙側(cè)卵巢，于子宮頸部結(jié)扎后切除卵巢，縫合傷口。Sham組尋找到卵巢后僅切除部分脂肪組織，縫合傷口。置于無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水3個(gè)月后取雙側(cè)股骨進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。

2 組織學(xué)檢測(cè)

取小鼠雙側(cè)脛骨及股骨，多聚甲醛固定4h后置于10%乙二胺四乙酸(EDTA)內(nèi)脫鈣10d，隔天換液。流水沖洗過(guò)夜后石蠟包埋，常規(guī)切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察并照相。

3 BMMSC體外培養(yǎng)

小鼠BMMSC的體外培養(yǎng)參照以往的方法。小鼠頸椎脫臼后剝?nèi)」晒羌懊劰?，剔除表面肌肉及軟組織，以1ml針管沖洗骨髓后接種于含10%胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)的α-最小必須培養(yǎng)基(α-MEM)內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每2天半量換液，當(dāng)密度達(dá)到80%后以2×104/cm2的密度傳代。

4 生長(zhǎng)曲線

采用P3代的小鼠細(xì)胞以5×104每孔分別接種于12孔板中，接種后2、4、6、8、10、12、14、16d以胰酶消化后計(jì)數(shù)。

5 成骨誘導(dǎo)及檢測(cè)

成骨誘導(dǎo)液配方為α-MEM，加入10% FBS，100nmol/L地塞米松，5mmol/L甘油磷酸鈉和50μg/ml左旋維生素C(Sigma公司)。細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，待密度達(dá)到85%以后加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21d。以4%甲醛固定后，采用茜素紅染色檢測(cè)成骨分化，并以10%西吡氯銨洗脫后用分光光度計(jì)檢測(cè)570nm光吸收值，行定量分析。

6 成脂誘導(dǎo)及檢測(cè)

成脂誘導(dǎo)液配方為α-MEM，加入10% FBS，0.5nmol/L異丁基甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma)，2μmol/L胰島素(Sigma)和10nmol/L地塞米松(Sigma)。細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，待密度達(dá)到95%以后加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14d。以4%甲醛固定后，采用油紅染色檢測(cè)成脂分化，并以異丙醇洗脫后用分光光度計(jì)檢測(cè)520nm光吸收值，行定量分析。

7 microRNA芯片分析

取術(shù)后3個(gè)月OVX組及sham組小鼠各9只，取股骨及脛骨骨髓常規(guī)培養(yǎng)BMMSC，待原代細(xì)胞密度達(dá)到80%后分別提取RNA，質(zhì)檢合格后以同組每3個(gè)RNA樣本等量混合，將得到的每組各3個(gè)混合RNA混合樣本行雙色microRNA微陣列芯片檢測(cè)(LC-μParafloTM微流體芯片，杭州聯(lián)川生物信息技術(shù)有限公司)。3張芯片的信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1 C57小鼠骨質(zhì)疏松模型的建立及鑒定

C57小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后3個(gè)月，進(jìn)行體重檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OVX組小鼠體重明顯重于Sham組。頸椎脫臼處死后，尸檢在OVX組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)卵巢，且子宮明顯萎縮;而Sham組具有正常的卵巢。取股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)(圖1)，均顯示OVX組股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨吸收明顯，骨小梁數(shù)量低于Sham組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)干骺端生長(zhǎng)板也較正常變薄，可能軟骨的形成和再生也受到了雌激素的影響。但是皮質(zhì)骨厚度和結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化，這與以往研究報(bào)道相一致，因?yàn)槠べ|(zhì)骨的改建需要較長(zhǎng)的時(shí)間。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功建立了OVX小鼠骨質(zhì)疏松模型。

2 OVX小鼠中BMMSC的增殖能力下降，多向分化能力改變

將OVX組及Sham組小鼠BMMSC進(jìn)行常規(guī)體外培養(yǎng)，取P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖和多向分化能力檢測(cè)。結(jié)果 顯示，OVX組BMMSC體外擴(kuò)增能力較Sham組有一定下降(圖2)。對(duì)BMMSC進(jìn)行分化能力檢測(cè)，成骨誘導(dǎo)染色后鏡下可以觀察到OVX組形成的鈣化結(jié)節(jié)較Sham組少，染色淺(圖3、4);但成脂誘導(dǎo)時(shí)OVX組有更多的脂滴形成(圖5、6);定量檢測(cè)也證明了這些區(qū)別(P＜0.05)。證明OVX組BMMSC成骨分化能力要低于Sham組，而成脂分化能力則較強(qiáng)，與觀察到的組織學(xué)表現(xiàn)相一致。提示BMMSC的功能異常確實(shí)在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中發(fā)生了重要的作用。

3 OVX小鼠BMMSC的功能障礙受到多種方式調(diào)控

通過(guò)對(duì)OVX組和Sham組BMMSC中mRNA表達(dá)水平進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(圖7)，發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞成骨成脂分化相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因如骨鈣素(OCN)、脂蛋白酯酶(LPL)和堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)發(fā)生了明顯的改變，其變化趨勢(shì)與細(xì)胞成骨成脂分化功能改變相一致，但Runt蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)和過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-γ)這兩個(gè)在成骨成脂分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用的關(guān)鍵基因在mRNA水平并沒(méi)有發(fā)生明顯改變，提示可能在轉(zhuǎn)錄后水平受到了調(diào)控。

通過(guò)對(duì)兩組BMMSC細(xì)胞RNA樣本進(jìn)行microRNA微陣列芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OVX組BMMSC的microRNA表達(dá)譜與Sham組相比發(fā)生了較明顯的改變。在BMMSC表達(dá)的339種已知microRNA中，有71種出現(xiàn)差異性表達(dá)，占所有表達(dá)microRNA的20.94%。其中，在OVX組中上調(diào)的microRNA為29種，而下調(diào)的microRNA為42種。倍數(shù)差異在4倍以上的microRNA有24種，占總microRNA的7.08%(表1)。以上數(shù)據(jù)表明，microRNA表達(dá)水平在OVX小鼠BMMSC中發(fā)生了較明顯的變化，可能在骨質(zhì)疏松BMMSC中功能改變中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

圖1 Sham及OVX組股骨遠(yuǎn)端切片(箭頭標(biāo)示為骨小梁結(jié)構(gòu))(HE×10倍)

圖2 兩種BMMSC生長(zhǎng)曲線比較

圖3 兩種BMMSC成骨分化后形成的鈣化結(jié)節(jié)(茜素紅×100倍)

圖4 兩種BMMSC成骨分化定量分析

圖5 兩種BMMSC成脂分化后形成的脂滴(油紅 ×200倍)

圖6 兩種BMMSC成脂分化定量分析

圖7 兩種BMMSC基因表達(dá)RT-PCR結(jié)果

表1 芯片中差異性表達(dá)microRNA統(tǒng)計(jì)

討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在雌激素缺乏條件下，BMMSC在增殖及分化能力上都出現(xiàn)了一定的異常，并且此異常與骨質(zhì)疏松中成骨能力下降的表型相一致，從而可能在骨質(zhì)疏松的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到了一定的促進(jìn)作用。有研究報(bào)道［1］，在骨質(zhì)疏松發(fā)生早期，破骨細(xì)胞的過(guò)度活化發(fā)揮了主要作用，但隨著病情的發(fā)展，成骨功能的下降是導(dǎo)致后期骨質(zhì)疏松加重的主要因素。我們的研究采用的是去勢(shì)后3個(gè)月的小鼠，從骨質(zhì)吸收情況看，已經(jīng)到達(dá)了中后期，此期BMMSC功能異常所導(dǎo)致的成骨功能缺陷可能發(fā)揮了更為重要的作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以觀察去勢(shì)小鼠短期和長(zhǎng)期BMMSC的生物學(xué)行為改變，并與中后期BMMSC相比較，從而觀察BMMSC在骨質(zhì)疏松發(fā)病全程中的動(dòng)態(tài)功能改變。

同時(shí)，我們觀察到，雖然造成去勢(shì)后骨質(zhì)疏松的啟動(dòng)因素是由于雌激素水平的下降，但是當(dāng)OVX組BMMSC進(jìn)行正常體外培養(yǎng)(含雌激素培養(yǎng)基)時(shí)，BMMSC功能缺陷在體外培養(yǎng)期間(30d左右)并沒(méi)有恢復(fù)，其增殖及分化能力中仍存在異常。一方面，因?yàn)锽MMSC自身表達(dá)雌激素受體，受到雌激素的直接調(diào)控，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期的激素缺乏可能對(duì)細(xì)胞造成一種“記憶效應(yīng)”［14］，造成細(xì)胞難以短期逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)行為改變，但是當(dāng)雌激素水平恢復(fù)后能否完全逆轉(zhuǎn)或者多長(zhǎng)時(shí)間能夠逆轉(zhuǎn)其功能改變將是一個(gè)有意義的課題，將為以后臨床作用于BMMSC治療的療效提供參考依據(jù)。另一方面，因?yàn)榇萍に氐陌悬c(diǎn)廣泛分布于全身各種組織和細(xì)胞中，雌激素水平的下降將引發(fā)全身一系列的改變，所以BMMSC也可能受到活化輔助性T細(xì)胞(Th)、繼發(fā)性激素改變、代謝改變等多種因素的共同作用，最終導(dǎo)致功能異常，所以單純體外恢復(fù)雌激素水平不能完全恢復(fù)其功能改變［15］。

因?yàn)楦杉?xì)胞的功能很大程度上由重要功能基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)決定，所以我們對(duì)成骨分化相關(guān)的ALP、OCN、RUNX2以及成脂分化相關(guān)的LPL、PPAR-r等重要基因進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALP、OCN、LPL的表達(dá)改變與BMMSC的功能改變相一致，但是RUNX2以及PPAR-r的變化不明顯。由于近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)了microRNA在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮了很重要的作用，所以骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的BMMSC功能缺陷不僅由基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)所引起，也可能由microRNA表達(dá)譜及表達(dá)水平的改變所決定。microRNA微陣列芯片的結(jié)果也支持我們的推斷，約1/5的microRNA表達(dá)發(fā)生了改變。但是，因?yàn)閙icroRNA具有1個(gè)microRNA調(diào)控多個(gè)靶基因或者1個(gè)靶基因受多個(gè)microRNA調(diào)控的特點(diǎn)，所以具體是哪些microRNA參與了重要分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以及具體如何調(diào)控，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明了在雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松中，BMMSC的增殖能力減弱，成骨能力減弱，而成脂能力增強(qiáng)，這些功能障礙可能在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。而BMMSC的功能障礙可能是由基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控異常所共同引起。

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