豬圓環(huán)病毒疫苗的研究進展

劉長明，陸月華，郭龍軍，危艷武

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

豬圓環(huán)病毒疫苗的研究進展

劉長明，陸月華，郭龍軍，危艷武

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2）主要引起以患豬全身性淋巴結(jié)腫大為特征的多系統(tǒng)功能衰竭性疾病，臨床上表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、母豬繁殖障礙、壞死性淋巴結(jié)炎、肉芽腫性腸炎和滲出性表皮炎等，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病。本病于1991年在加拿大被發(fā)現(xiàn)，相繼北美、歐洲、亞洲等幾乎所有養(yǎng)豬國家均有本病流行的報道。由于PCV2與其他多種病原混合感染情況不盡相同，豬群發(fā)病后死亡率不等，較嚴重的地區(qū)暴病時死淘率高達40%，被公認為繼豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）之后，新發(fā)豬的重要傳染病。我國豬群中PCV2感染十分普遍，流行病學(xué)調(diào)查表明，PCV2抗體陽性率高達80%以上，被調(diào)查的豬場陽性率達100%，尚未發(fā)現(xiàn)有抗體陰性豬場存在。PCV2感染途徑主要以糞口為主，病毒先定殖于扁桃體，隨血流進入周身淋巴結(jié)。在淋巴細胞中大量繁殖擴增，形成了不同程度的病毒血癥。當病毒滴度高時，往往血清抗體滴度較低，臨床上就會呈現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀。大部分豬只在病毒感染后幾周內(nèi)會刺激產(chǎn)生高水平的抗體，抗體能夠?qū)⒉《究乖泻?，臨床上表現(xiàn)為耐過康復(fù)。

一、PCV2的臨床表現(xiàn)

根據(jù)病毒感染不同階段豬后表現(xiàn)的臨床癥狀有所不同，主要分為以下四種。

1.斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。發(fā)生于5～12周齡保育豬，臨床表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸急促、呼吸困難、黃疸、下痢、皮膚蒼白和中樞神經(jīng)失調(diào)等癥狀。病理變化為全身淋巴結(jié)腫大，淋巴器官的肉芽腫性炎癥和不同程度的淋巴細胞缺失，解剖還可見肺斑點狀出血。

2.豬皮炎腎病綜合征。發(fā)生于2～4月齡生長豬，臨床表現(xiàn)為多處局限性微凸出的暗紅色病灶，此后迅速發(fā)熱，直腸溫度可達41℃以上，出現(xiàn)皮下水腫、厭食、體重減輕和抑郁等。通常病豬在3 d內(nèi)死亡，死亡率約為20%。病理變化主要為出血性壞死性皮炎和動脈炎以及滲出性腎小球腎炎和間質(zhì)性腎炎，出現(xiàn)腹水和心包積液。常與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征同時爆發(fā)。

3.豬呼吸道疾病綜合征。發(fā)生于16～22周齡生長豬和育肥豬，臨床表現(xiàn)為生長遲緩、飼料利用率下降、嗜睡、厭食、發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難。組織病理學(xué)變化有支氣管間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)肺部廣泛性的肉芽腫性炎癥。

4.母豬繁殖障礙。臨床表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎增多、斷乳前死亡率上升。多數(shù)在妊娠晚期流產(chǎn)和娩出接近成熟的死胎或早產(chǎn)仔豬；在妊娠中期也會出現(xiàn)流產(chǎn)、木乃伊胎兒和早期胚胎死亡。病毒感染母豬受胎率降低或不孕，斷奶前仔豬死亡率上升達10%以上，以垂直傳播方式傳播。

二、流行毒株變異

大量的流行病學(xué)研究表明，我國豬群中PCV2感染十分普遍。劉長明等（2007）采用免疫過氧化物酶單層細胞染色試驗（IPMA）方法，對來自黑龍江、吉林、河北、上海、內(nèi)蒙、云南、江西等地豬場健康成年豬血清480份和發(fā)病豬血清424份進行了檢測，抗體陽性率分別為91.7%和79.2%，送檢樣品的12個豬場均為陽性，表明PCV2在我國豬群中感染率非常嚴重。盡管PCV2抗體陽性檢測率較高，但各豬場的發(fā)病率與死亡率差異較大，主要歸因于豬場飼養(yǎng)技術(shù)水平不同，豬群中PCV2與混合感染的病原種類有很大關(guān)系。對發(fā)病豬場送檢的病料檢測，PCV2陽性樣品中多數(shù)與高致病PRRSV變異株混合感染，在保育階段仔豬死亡率達50%以上。范培虎等用發(fā)生高熱癥豬場分離的PCV2和PRRSV變異毒株進行本動物感染試驗，試驗分為單獨感染PCV2、PRRSV，兩種病毒同時或先后順序感染組。PCV2、PRRSV單獨感染組與混感感染組對比，后者出現(xiàn)更為嚴重的臨床癥狀，先感染PRRSV一周后再感染PCV2試驗組，出現(xiàn)了高達60%的死亡率，基本能夠再現(xiàn)發(fā)病豬場的狀況。這些研究表明，目前在我國豬群中，PCV2與PRRSV混合感染是造成養(yǎng)豬業(yè)嚴重損失的主要原因。郭龍軍等（2009）對我國10個省份不同地區(qū)送檢的90份病料中分離到19株P(guān)CV2流行毒株。通過病毒基因組克隆和測序，將19株病毒分為2個大基因群和3個亞群：PCV2a、PCV2b、PCV2d；其基因組構(gòu)成依次為1766nt、1767nt和1768nt，各占15.8%、73.7%和10.5%。若以1767nt毒株為基準，其第39或1039位有1個堿基缺失后突變成1766nt毒株；第1040位有1個堿基插入后突變成1768nt毒株。對19株病毒ORF2編碼的Cap蛋白分析發(fā)現(xiàn)，有4株病毒編碼基因發(fā)生了突變，出現(xiàn)了705nt和708nt兩種突變型，使ORF2編碼的Cap蛋白C末端分別有1和2個氨基酸延伸。研究表明，我國豬群中流行的PCV2以PCV2b亞型流行毒株為主。Harding等分別用PCV2a和PCV2b亞型毒株接種試驗豬，證明兩種類型毒株在毒力上無明顯差異。

三、國外PCV2疫苗

國外對PCV2做了大量研究，Blanchard等對PCV2基因疫苗與滅活疫苗的免疫效力進行了比較，證明基因疫苗可誘導(dǎo)機體免疫保護，單獨用PCV2基因疫苗2次免疫的效果低于滅活疫苗，滅活疫苗能完全抑制PCV2的增殖。Fenaux等用滅活苗免疫豬可刺激產(chǎn)生特異性抗體，減少病毒血癥的發(fā)生，有效地阻止肺部病變。國外商品化疫苗中，勃林格殷格翰公司研制的PCV2亞單位疫苗，將PCV2 ORF2基因插入到昆蟲桿狀病毒，用昆蟲細胞培養(yǎng)獲得的重組PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗；該疫苗免疫組豬平均死亡率為2.4%，對照組死亡率為9.5%。先靈葆雅公司研制的PCV2滅活疫苗，在加拿大22個豬場進行的多中心隨機試驗，在保育和肥育期未接種疫苗對照組平均死亡率為9.3%，疫苗免疫組為2.1%。法國梅里亞公司研制的PCV2全病毒滅活苗用于母豬免疫，在多個國家試驗表明，疫苗免疫母豬群獲得了群體性免疫力，仔豬可從初乳中獲得母源抗體，在5周內(nèi)能夠有效預(yù)防PCV2感染。美國富道公司開發(fā)的Suvaxvn PCV1/PCV2重組滅活疫苗，在6個豬場臨床試驗，在生長/肥育期未接種疫苗對照組平均死亡率為7.7%，疫苗免疫組死亡率為1.8%?？傊瑖庋兄频腜CV2疫苗均取得良好免疫效果，疫苗售價也十分昂貴，每頭份達5～10美元。

四、國產(chǎn)PCV2疫苗的研制

我國對PCV2疫苗研究起步較晚，一直沒有商品化疫苗問世。針對該病的流行態(tài)勢及危害的嚴重性，盡快研制出適合國情的疫苗非常必要，市場需求十分迫切。鑒于PCV2基因組構(gòu)成簡單，病毒變異幅度較小，通過細胞傳代很難達到完全致弱，且弱毒疫苗容易造成因毒力反強引起疫病再流行。滅活苗是經(jīng)細胞培養(yǎng)大量增殖病毒，加入滅活劑將病毒殺死，具有安全性好、便于貯存運輸和抗母源抗體干擾等優(yōu)點。此外，當今人們更加關(guān)注能夠設(shè)計出一種具有帶有分子標識的疫苗，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，采用感染性分子克隆技術(shù)構(gòu)建標記毒株成為可能。PCV2感染細胞不易產(chǎn)生致細胞病變，常規(guī)病毒學(xué)操作很難達到病毒克隆純化，構(gòu)建PCV2感染性分子克隆獲得具有分子標識的毒株，為疫苗毒株與野生毒株間的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。我們采用國內(nèi)自行分離的毒株，采用感染性分子克隆技術(shù)獲得了具有分子標記毒株作為毒種，經(jīng)細胞培養(yǎng)傳代，培育成功一株體外培養(yǎng)適應(yīng)毒株，對病毒繁殖規(guī)律、毒價測定、血清學(xué)檢測、形態(tài)學(xué)鑒定、核酸序列分析、動物感染模型、疫苗生產(chǎn)工藝、佐劑篩選、動物免疫安全性及免疫效力等進行了系統(tǒng)試驗，研制成功我國首例PCV2滅活疫苗，種毒獲得國家發(fā)明專利，疫苗獲得國家二類新獸藥證書，并轉(zhuǎn)讓給兩家企業(yè)投入生產(chǎn)。為配合疫苗免疫效果評價，研制成功配套血清抗體檢測試劑盒。該成果為我國有效防控本病的流行提供了技術(shù)手段。本成果擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，屬于原始創(chuàng)新。

五、國產(chǎn)疫苗特點

國產(chǎn)疫苗采用無PCV1豬腎傳代細胞系培養(yǎng)增殖病毒，病毒液經(jīng)甲醛溶液滅活后，與進口佐劑混合乳化而成，用于預(yù)防PCV2感染豬只引起的相關(guān)疾病。研制的疫苗具有如下特點。(1）構(gòu)建的感染性分子克隆毒株，在基因組內(nèi)插入了一個分子標簽，可用PCR-RFLP與野生型毒株相鑒別。(2）疫苗毒株經(jīng)細胞培養(yǎng)傳60代，繁殖性能穩(wěn)定，毒價達106.6 TCID50/ml，制備的疫苗抗原含量高。(3）病毒滅活后排除了再感染靶動物的能力，安全性好。(4）采用進口的水包油劑型佐劑，接種后刺激機體產(chǎn)生抗體快、效價高。(5）疫苗對任何品種、年齡的健康豬群接種后無任何毒副作用。（6）疫苗免疫豬攻毒保護率達96%以上，免疫期為6個月。（7）疫苗抗母源抗體干擾強，不受母源抗體的影響，能夠完全抵抗病毒感染。（8）臨床應(yīng)用效果顯著，在全國175個規(guī)模化養(yǎng)豬場推廣應(yīng)用統(tǒng)計，沒有1個豬場出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，平均死亡率降低8%，平均出欄率提早5～7 d，藥物使用量減少30%，每頭豬節(jié)約成本50元。（9）與進口疫苗對比，主要性能指標相當，售價僅為進口產(chǎn)品1/3，為養(yǎng)豬業(yè)節(jié)約大量疫苗費用。（10）配套的血清抗體檢測診斷試劑盒，為疫苗免疫效果評價提供了手段。

略）