異體骨復合移植的研究進展

楊 磊，劉光軍，王 謙，張大偉，譚 琪，高志剛

目前同種異體骨已成為臨床修復節(jié)段性骨缺損的首選方法，但隨著應用的廣泛，一些單純利用異體骨處理技術手段難以解決的問題也暴露出來，如免疫排斥、晚期感染、移植骨愈合緩慢等。隨著異體骨制備工藝水平的提高，對異體骨移植后生物相容性機制、骨傳導機制、骨誘導機制及大段異體骨移植生物力學研究的深入，更重要的是分子生物學、基因工程技術、組織工程技術的發(fā)展，通過更好的處理方法使異體骨在生物學特征、理化性能等方面接近或達到理想骨替代材料的要求成為可能。這種可能具體表現(xiàn)在復合異體骨移植的研究和應用，主要包括以下幾種：①異體骨與組織學技術相結合-復合自體紅骨髓移植；②異體骨與骨組織工程技術相結合-復合種子細胞、細胞因子移植；③異體骨與顯微外科技術相結合-異體骨復合帶血管的骨瓣、骨膜瓣移植?，F(xiàn)綜述如下。

1 復合自體紅骨髓的同種異體骨移植

自體紅骨髓是最早被應用于復合骨移植的成骨活性物質。隨著組織學研究的進展，現(xiàn)已知自體紅骨髓的成骨活性主要來源于骨髓基質和骨祖細胞。骨祖細胞有兩大類：①誘導性骨祖細胞（inducible osteogenic precursor cell，IOPC）：為未分化的間葉細胞，存在于所有結締組織中，在骨形成蛋白等生長因子作用下可轉化成成骨細胞系；②定向骨祖細胞（determined osteogenic precursor cell，DOPC）：僅存在于骨髓基質和骨表面上，由骨髓多潛能干細胞轉化而來，為已分化的骨系。骨髓是唯一含有豐富的定向性和誘導性骨祖細胞的組織，且骨髓間葉細胞的誘導成骨活性最強。骨髓中的單核細胞和血小板等也能產生多種生長刺激因子，具有促進骨修復的作用。

單純的紅骨髓移植具有操作安全、簡單、費用低、創(chuàng)傷小的優(yōu)點，臨床應用于治療骨折延遲愈合及不愈合獲得較好的治療效果。但是骨髓具有一定的流動性，單純植入后易擴散，不能在植入部位形成有效濃度，也不能提供力學的穩(wěn)定性，降低了其成骨效果。同種異體骨作為骨髓的載體避免了截取自體骨的并發(fā)癥，并具有組織相容性好、結構與宿主骨相近、適于血管進入和細胞吸附等優(yōu)點。

Bruwell[1，2]最早設計了此類研究的動物實驗，即將除去骨髓的新鮮同種髂骨用自體紅骨髓浸泡，制成新鮮同種自體復合骨移植于肌肉，結果此復合骨具有與同種髂骨相同的成骨能力，而單獨移植自體紅骨髓于肌肉則只有43%的動物有新骨形成。趙家駒等[3]利用異體松質骨復合自體紅骨髓移植治療粉碎性骨折、骨缺損和骨不連56例，獲得8個月以上隨訪的28例均骨性愈合。胡懿郃等[4]應用同種異體脫鈣骨與自體紅骨髓復合移植治療58例66處長骨良性腫瘤刮除后骨缺損，術后隨訪42例49處骨缺損，隨訪時間1～3年，49處骨缺損均在9個月內骨性愈合，平均時間為6個月，優(yōu)良率93%?？字緞偟萚5]應用同種異體松質骨復合自體紅骨髓移植治療創(chuàng)傷性骨缺損38例。結果，38例切口均Ⅰ期愈合。復查X線片示36例達骨性愈合，1例感染性骨缺損移植后遲發(fā)性感染，去除內固定及同種異體骨，置管沖洗、局部穩(wěn)定后再次植骨愈合，隨訪25個月骨感染未復發(fā)；1例鋼板松動致骨折未愈合，再次行內固定、自體骨移植后骨折愈合。根據(jù)Mankin等和Komender等標準評定，滿意36例，不滿意2例。印衛(wèi)鋒等[6]應用同種異體骨材料復合自體濃縮紅骨髓移植治療良性骨腫瘤和瘤樣病變108例，采用異異體骨材料復合自體濃縮紅骨髓移植52例（復合紅骨髓植骨組），單純異體骨移植56例（單純植骨組），100例患者達骨性融合（復合紅骨髓移植組49例，單純植骨組51例），并獲得24個月隨訪。復合紅骨髓植骨組移植骨界限模糊時間和消失時間均短于單純植骨組，骨密度也高于單純植骨組（P=0.05～0.01）。術后3、6、12個月時復合紅骨髓植骨組骨密度高于單純植骨組（P=0.05～0.01）。復合紅骨髓植骨組2例，單純植骨組3例出現(xiàn)排異反應，使用免疫抑制劑治療二三周后痊愈。

2 復合骨髓間充質干細胞的同種異體骨移植

骨組織工程的發(fā)展為骨缺損的治療提供了全新的思路。骨組織工程的概念可以定義為：通過將一定密度的種子細胞植入生物相容性良好，可降解吸收的支架材料中，并輔以適當?shù)纳L因子，通過一定時間的體外培養(yǎng)，然后將這種復合骨植入到受損傷的部位以達到修復損傷的目的。

2.1 種子細胞 早期的研究通常將成骨細胞作為種子細胞，因為骨的生長是由成骨細胞向周圍分泌機制和纖維將自身包埋于其中，形成類骨質，在鈣鹽沉積后礦化成骨。成骨細胞易存活，來源廣泛，有一定的增殖能力，但存在的最大問題是提取的問題，會對細胞供體必不可避免的造成損傷。

隨著細胞工程和基因研究的進展，骨髓間充質干細胞進入了人們的視野。骨髓間充質干細胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一群存在于骨髓中的非造血干細胞，在不同誘導條件下具有定向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞分化的潛能。因其來源不受限，取材簡單，對供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，且具有強大的體外分裂增殖能力及較短的細胞培養(yǎng)周期，隨著骨組織工程技術的發(fā)展，BMSCs已成為公認的種子細胞首選。

趙謙等[7]用自體BMSCs復合異體松質骨基質修復兔橈骨節(jié)段性缺損，結果表明自體BMSCs-異體松質骨基質復合物在骨缺損愈合過程中其成骨量、成骨速度及時間均優(yōu)于單純異體松質骨移植。柴崗等[8]將自體BMSCs與部分異體脫鈣復合構建的組織工程骨用于修復顱骨和頜面骨缺損11例，結果，術后3～6個月能形成組織工程化骨，并修復骨組織缺損，術后1～2.5年隨訪表明組織工程骨穩(wěn)定存在，無明顯骨吸收現(xiàn)象。楊柏林等[9]將同種異體骨髓間充質干細胞復合膠原海綿修復兔橈骨缺損，建立兔橈骨缺損（1.5 cm）模型，45只新西蘭大白兔隨機分為3組：同種異體BMSCs/CS組（A組），單純膠原海綿組（B組），空白對照組（C組）。結果：eGFP標記的BMSCs異體移植存活時間超過3周。X線片示12周A組大白兔5只中有4只達到骨性連接。新生骨量呈A組-C組遞減，至12周無一愈合。隨著時間推移，A組編織骨髓腔和骨小梁增多，修復過程優(yōu)于B、C組。A組生物力學指標均低于健側正常對照組，但各指標能達到正常組的80%～90%。結論：同種異體BMSCs復合CS可以修復1.5 cm兔橈骨缺損。方志輝等[10]從選取的有關生物材料復合骨髓間充質干細胞修復骨缺損的實驗中，證實了骨髓間充質干細胞可以和多種生物材料有效復合，并可以向成骨細胞分化。提示骨髓間充質干細胞可以促進各種支架材料修復骨缺損的新骨成骨能力。

2.2 支架材料 目前骨組織工程研究報道中，同種異體脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）用于組織工程骨支架材料報道較多。這是由于同其它無機、有機材料相比較，DBM在細胞相容性、組織相容性、理化性能和生物安全性方面具有一定的優(yōu)勢，保留了部分新鮮骨的骨誘導活性；具體表現(xiàn)在：①DBM的加工工藝成熟簡便；②具有極低的免疫原性、良好的細胞相容和組織相容性的同時還具有消毒后保持其骨誘導能力的特性；③本身具有一定力學強度，通過改變脫鈣率可以改變其力學強度，以適應臨床不同植骨部位的需求；④通過采集前病原學檢查和相應的加工處理，可保持其具有良好的生物安全性。

來源于人體的DBM具有天然的網(wǎng)孔樣結構，符合人體正常的生理要求，且材料可隨成骨的進展逐步降解吸收，降解的過程中不會產生對受體及局部成骨有害的酸性代謝產物。

Kasten等[11]對部分脫鈣的羥基磷灰石（HA）、β-磷酸三鈣（β-TCP）和DBM從種子細胞的粘附率、長入支架內部的數(shù)量、增殖和分化效率等方面作過比較，認為DBM效果最佳。Tsuang等[12]將大鼠的成骨細胞與天然的Pyrost骨體外復合培養(yǎng)，結果Pyrost骨不僅有利于成骨細胞的粘附，而且還促進骨細胞增殖。Hofman等[13]將成骨細胞分別與2種不同理化方法處理的天然異種骨Laddec骨和Bio-Oss骨體外復合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，前者周圍形成的礦化骨量比后者多15%，表明Laddec骨可以為成骨細胞提供更加適宜的成骨環(huán)境。Zhang等[14]的研究表明未脫鈣骨無誘導成骨活性，當鈣殘留量為脫鈣骨基質質量的2%時，誘導的新生骨量最多，低于1.2%時則誘導成骨量下降。因為脫鈣骨基質中保留適當?shù)腃a可成為新生骨的鈣化核心，為磷酸鈣的沉積提供晶核。Andre等[15]的研究表明膠原在無細胞的培養(yǎng)液中可有礦物質的沉積，過度洗滌膠原或磷含量低于0.01%將完全抑制礦物質在膠原上的沉積，膠原內加入磷酸鹽可恢復其礦化能力，說明磷酸鹽是一個潛在的礦化中心。

據(jù)上述研究可知：作為組織工程支架的同種異體骨的制備原則是：既要有適當?shù)牡V物質脫出，以利于更多的BMP釋放；又要保留適當?shù)拟}磷化合物，以利于更多的礦化新生骨。

李裕標等[16]研究了DBM作為組織工程骨支架的可能性；楊志明等[17]采用特殊理化方法制的三種同種異體骨支架材料，均具有良好的細胞相容性、組織相容性和成骨作用；楊志明等[18，19]還將組織工程肋骨用于臨床移植治療，效果較好。劉順振等[20]，總結骨組織工程支架材料的研究進展，并展望其發(fā)展趨勢。認為，支架材料是構建組織工程骨的主體，行使細胞外基質的功能，包括為組織細胞的修復活動提供適宜的微環(huán)境，抵擋來自周圍組織的壓力，用于承重部位暫時行使部分功能等。目前人工合成材料和天然材料各有優(yōu)缺點。人工合成材料現(xiàn)存問題主要在于材料的細胞粘附率低，難以完全降解，致畸性和致癌性有待明確；天然材料則需要更好地解決材料的抗原性和機械性能的關系，降解速度的調控問題。充分了解現(xiàn)有材料的特點為尋找新方法及新材料提供理論依據(jù)。段禮府等[21]，探尋異種脫鈣骨基質和骨髓間充質干細胞聯(lián)合植入乳突腔的成骨效能。利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離近交系雌性豚鼠骨髓間充質干細胞，牛股骨頭松質骨制備牛髂骨脫鈣骨基質。結論：異種脫鈣骨基質與骨髓間充質干細胞聯(lián)合植入乳突腔能有效促進乳突填塞后骨的形成。

3 復合細胞因子的同種異體骨移植

復合同種異體骨支架材料進行移植的細胞因子報道最多的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）。BMP自1965年發(fā)現(xiàn)以來，已被大量實驗證明有誘導成骨作用，且是唯一能夠單獨誘導骨組織形成的局部生長因子。BMP作用機制為：在一定條件下能誘導未分化的間充質細胞向骨系細胞轉化，促進骨細胞的生長增殖。

BMP在骨組織中的含量極少（約1 mg/kg濕骨），且在體內擴散很快，容易被蛋白酶所分解，因此不能在局部發(fā)揮持續(xù)刺激和誘導成骨作用，其誘導成骨作用難以充分發(fā)揮，故必須與一定的載體相結合才可以。隨著基因重組技術的進步，BMP的生成、提取及純化技術越來越成熟，已有多種商品化的BMP面市。

與BMP符合的同種異體骨常用的有：脫蛋白骨（deproteined bone，DPB）、煅燒骨、DBM 及將 DBM 進一步利用化學方法加工而成的脫礦骨基質膠 （demineralized bone matrix gel，DBG）， 又稱為骨基質明膠 （bone matrix gelatin，BMG）。BMG中徹底去除了BMP之外95%的非膠原性蛋白質和脂類，使其抗原性進一步下降，與BMP復合具有更高效的、更恒定的骨誘導作用，是公認的較理想的骨修復材料。

Kirker用綿羊的異體DBM復合rhBMP-2修復2.5 cm的骨缺損，術后2～4周即可從X線片上見到新骨形成，52周髓腔再通，為異體骨移植中應用BMP提供了實驗依據(jù)[22]。曹瑋等[23]，應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物聯(lián)合自體紅骨髓移植治療四肢良性骨腫瘤與瘤樣病變32例，32例在6～13月達到骨性愈合標準，平均8.6個月，移植骨與宿主物界限消失多在10個月后。

除BMP外還有許多生長因子參與骨代謝。孫玉鵬等[24]將轉化生長因子（transforming groth factor，TGF-β）負壓吸引到部分脫蛋白骨上，凍干后植入兔橈骨1.0 cm節(jié)段性缺損，術后12周骨缺損完全修復。

早期研究證明TGF-β只有在BMP存在的情況下，才能誘導成骨。近年來研究發(fā)現(xiàn)BMP有40多種，除BMP-1是原膠原C端蛋白酶外，其余均屬于TGF-β超家族的成員。BMPs各成員誘導成骨能力不同，其中BMP-2和BMP-7誘導成骨活性最強。2001年經(jīng)FDA批準的商品化的rhBMPs即為 rhBMP-2（INFUSE）和 rhBMP-7（OP-1）。

王銳等[25]，骨重建涉及一系列成骨細胞（OB）和破骨細胞（OC）的信息交換，是一個由循環(huán)激素局部因子共同調節(jié)的復雜過程。轉化生長因子β（TGF-β）在骨形成和骨吸收中的平衡方面起重要作用。

4 復合帶血管的自體骨瓣、骨膜瓣復合異體骨移植

4.1 帶血管的腓骨瓣 隨著顯微外科技術的不斷發(fā)展，吻合血管的自體腓骨移植修復骨缺損得到了較廣泛的應用。吻合血管的自體骨移植含有成骨活性的骨細胞，有獨立和豐富的血供，其愈合過程由爬行替代轉化為一般的骨折愈合過程，愈合時間短，成功率高，能一期修復骨缺損，是公認的最佳骨移植方法。但因其數(shù)量有限、結構缺陷、不能早期負重、不可避免的對受體副損傷，應用于四肢大段骨缺損的修復有一定的局限性。

帶血管的自體腓骨瓣與大段異體骨有兩種組合方式即：捆綁式和嵌套式。嵌套式復合移植因帶血管的腓骨瓣套疊在長段同種異體骨骨髓腔內，更使復合骨移植形成一個“全方位、多形式”的愈合。

Moran等[26]應用自體腓骨與異體骨復合移植對7例下肢惡性骨腫瘤患者進行保肢手術，隨訪2～6年，平均骨愈合時間為9個月，無一出現(xiàn)感染或異體骨骨折，保肢成功率100%。楊運發(fā)等[27]對帶血管的自體腓骨與異體骨復合移植進行了系列研究，并在修復四肢長管狀骨缺損中取得了較好了臨床效果。陳灼彬等[28]，應用吻合血管腓骨皮瓣組合異體骨移植治療下肢軟組織伴大段骨缺損，自體骨與異體骨愈合良好，可改善患肢功能并減少傷殘率。

4.2 帶血管的骨膜瓣 骨膜分為外骨膜和內骨膜，外骨膜組織學上分為淺層的纖維層及深層的生發(fā)層，纖維層含有骨膜的固有血管，生發(fā)層細胞為具有終身分化潛能的間充質細胞，在局部血供好、氧分壓高的環(huán)境中分化為成骨細胞、使骨膜成骨，在局部血供差、氧分壓低的環(huán)境中分化成軟骨細胞、使骨膜成軟骨，此外局部應力因素也對生發(fā)層細胞的分化有重要影響。

帶血管骨膜瓣移植能顯著改善受區(qū)血供，具有確切的成骨能力，且可根據(jù)受區(qū)情況塑形，與骨瓣移植相比優(yōu)點顯著，隨著顯微外科技術的發(fā)展，眾多新的骨膜瓣供區(qū)被發(fā)現(xiàn)，廣泛應用于臨床治療骨不連、陳舊性骨折、骨缺血壞死和骨缺損修復等[29，30]。

帶血管骨膜瓣對大段異體骨愈合的促進作用，主要表現(xiàn)在：帶血管骨膜瓣不僅能為大段異體骨帶有良好的血運，而且具有很強的成骨作用。

首先，骨膜瓣具有顯著的促進血管內皮細胞增生及毛細血管生成的作用，從而促進大段異體骨的血管化，加速大段異體骨中部的活化。其次，自體宿主骨向異體骨的爬行替代，依靠髓內和髓外二種途徑，即一是由自體宿主骨外膜、異體骨周圍肌肉間充質組織伴隨著毛細血骨的長人，帶來骨母細胞，形成橋梁骨痂，二是由髓內成骨細胞從宿主端向移植骨內移動、爬行，而形成內骨痂，而前者占主導作用。因此以骨膜瓣復合異體骨移植，間充質細胞轉化成為成骨細胞的數(shù)量顯著增加，新生骨痂的數(shù)量及速度顯著提高。再次，骨膜瓣內會產生大量的細胞因子，如BMP、VEGF、TGF等，帶血供骨膜包裹異體骨，可以較快地使移植物納入與宿主一致的生理反饋模式中，因此具有良好的骨生成、骨傳導及骨誘導的作用。

張峰等[31]通過動物實驗證明帶血管骨膜瓣對異體骨血管化有明顯促進作用。王劍利等[32]，采用自體帶血管骨（膜）與同種異體骨組合移植治療長段骨缺損，可改善大段異體骨移植的骨吸收、骨不連等并發(fā)癥，有利于骨折的早期愈合，為治療長段骨缺損較為理想的方法。陳磊等[33]，探討雙鋼板加骨間返動脈蒂尺骨上段骨膜瓣逆向轉位治療肱骨遠端骨折不愈的效果。認為，雙側重建鋼板聯(lián)合骨間返動脈為蒂的尺骨上段骨膜瓣逆向轉位治療肱骨遠端骨不連能促進骨折愈合。孟憲勇等[34]，利用以帶蒂筋膜瓣為膜材料應用膜引導性骨再生技術修復大段骨缺損，能有效限制纖維結締組織長入，具有效快速血管化能力，極大地加快了移植骨轉化為自體骨的速度及效果。胡振順等[35]，以帶蒂筋膜瓣為屏障膜具有MGBR作用，其包裹NTEB應用MGBR技術對促進ECSD修復療效顯著。

總而言之，異體骨復合移植的方法很多，各種方法有自己的特點、原理和注意事項。我們在實際臨床應用中，只有針對患者的具體病情選擇合適的復合方法，才會取得較好的治療效果。

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