微生物對(duì)食品安全的危害及其快速檢測(cè)技術(shù)

夏愛(ài)萍，龔鴻萍，鄭睿行

（衢州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)中心，浙江衢州，324002）

食品從生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷(xiāo)售，到食用的整個(gè)過(guò)程，每個(gè)環(huán)節(jié)都容易受到各種途徑的污染，產(chǎn)生對(duì)人體有害因素。因此食品的安全問(wèn)題，向來(lái)被每一個(gè)消費(fèi)者所關(guān)注。食品的污染，主要分兩類(lèi)：一類(lèi)是化學(xué)物質(zhì)對(duì)食品的污染, 主要表現(xiàn)為化學(xué)殘留物、重金屬污染物。另一類(lèi)是病原微生物所引起的食品污染，也稱生物性污染。這一類(lèi)狀況最易發(fā)生。微生物導(dǎo)致危害的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他來(lái)源的危害，它可引起因食品中細(xì)菌大量繁殖而導(dǎo)致食用者感染型中毒或因細(xì)菌繁殖產(chǎn)生菌毒素引起的毒素型中毒。細(xì)菌感染型中毒潛伏期較長(zhǎng)，通常為10 多個(gè)小時(shí)，伴有發(fā)燒；而毒素型中毒則僅為2～4小時(shí)，很少發(fā)燒。

1 對(duì)人體健康危害較嚴(yán)重的致病菌

1.1 沙門(mén)氏菌

沙門(mén)氏菌為革蘭氏陰性的不產(chǎn)孢子的桿菌，主要分布在動(dòng)物的腸道中，作為腸道菌群，它們會(huì)隨著糞便排泄出來(lái)，再由昆蟲(chóng)和其它動(dòng)物傳播到其它地方。沙門(mén)氏菌中毒往往源自病死牲畜肉、變質(zhì)動(dòng)物性食品和蛋類(lèi)，其所致的中毒是最常見(jiàn)食物中毒之一。中毒者會(huì)在進(jìn)食后短期內(nèi)出現(xiàn)急性胃腸癥狀，如惡心，頻繁性嘔吐，腹痛、腹瀉；重者可發(fā)生高熱、脫水、昏迷、抽搐，很快死亡。

1.2 大腸桿菌

大腸桿菌在正常人的腸道內(nèi)存在，一般情況下不致病，但食用被該菌污染的食物時(shí)就會(huì)致病。大腸桿菌進(jìn)入胃腸后會(huì)繼續(xù)繁殖，產(chǎn)生較重嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉等胃腸癥狀,引起胃腸粘膜充血、水腫等病變。大腸桿菌引起的感染為最嚴(yán)重的食源性疾病之一。

1.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌存在于海水中，因此各種海產(chǎn)食物的帶菌率很高。當(dāng)食用未煮熟海魚(yú)、海蜇，以及食用鹽腌制的并已被污染的肉類(lèi)、蛋類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、咸菜時(shí)，可引起中毒。中毒者胃腸癥狀嚴(yán)重，惡心嘔吐，腹痛，特別是腸糜爛、充血、水腫，并出現(xiàn)膿血水樣便，甚至發(fā)生休克、溶血現(xiàn)象。

1.4 李斯特菌

李斯特菌是革蘭氏陽(yáng)性、不產(chǎn)孢子和不耐酸的桿菌，它們?cè)谧匀唤绲姆植紡V泛，可以在腐爛的植物、土壤、動(dòng)物糞便、污水、青貯飼料和水中被發(fā)現(xiàn)，部分正常人體內(nèi)也可帶有此菌。中毒原因主要是奶及乳制品、肉制品、水產(chǎn)品和水果蔬菜等未經(jīng)煮熟、煮透，冰箱內(nèi)冷藏的熟食品、乳制品取出后直接食用所導(dǎo)致。中毒者在8～24 小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀。嚴(yán)重的可表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎等，也可引起心內(nèi)膜炎。

1.5 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌普遍存在于自然界中,正常人糞便中也可分離出此菌。金黃色葡萄球菌繁殖產(chǎn)生腸毒素常見(jiàn)于陳置米飯、淀粉類(lèi)食品與奶制品，中毒者表現(xiàn)出反復(fù)嘔吐、劇烈腹痛等癥狀。金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。

1.6 肉毒梭狀芽孢桿菌

肉毒桿菌食物中毒多由食用含有肉毒桿菌外毒素污染的食物而發(fā)生。此菌普遍存在于土壤家畜糞便中，可附著在水果、蔬菜、罐頭、火腿、膜腸肉里而大量繁殖外毒素，成人致死量為0.01mg。肉毒毒素主要侵犯神經(jīng)系統(tǒng)，中毒者會(huì)產(chǎn)生復(fù)視、肌肉麻痹、呼吸困難等癥狀，并伴有腦水腫和腦充血。

1.7 變形桿菌

變形桿菌在食品中能產(chǎn)生腸毒素，并且可以使蛋白質(zhì)中的組氨酸脫羧而形成組胺,從而引起胃腸炎或過(guò)敏性反應(yīng)。中毒所引起的疾病可呈惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、頭暈、頭痛及發(fā)熱等癥狀或皮膚潮紅、頭痛、酒醉貌、蕁麻疹等過(guò)敏反應(yīng)的表現(xiàn)[1]。

2 食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)

2.1 氣相色譜法

其原理是將微生物細(xì)胞經(jīng)過(guò)水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學(xué)組分供氣相色譜儀進(jìn)行分析。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數(shù)的峰是共性的，只有少數(shù)的峰具有特征性，可被用來(lái)進(jìn)行微生物鑒定，分析檢測(cè)各種常見(jiàn)細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。

2.2 “既用膠”測(cè)定法[2]

把1ml食物樣品傾入一盛有無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后再將混合物倒入一個(gè)裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中?；旌衔锱c膠質(zhì)接觸后便形成瓊脂相似的復(fù)合物。經(jīng)培養(yǎng)后便可計(jì)數(shù)菌種及數(shù)量。該系統(tǒng)是包裝好的產(chǎn)品，用時(shí)不需滅菌，極適合野外測(cè)定。目前，這種系統(tǒng)正在受到美國(guó)AOAC（官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會(huì)）的鑒定。

2.3 以生物化學(xué)手段建立的快速檢測(cè)技術(shù)

2.3.1 微生物專(zhuān)有酶快速反應(yīng)系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)

微生物專(zhuān)有酶快速反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將他們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助于細(xì)菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，并使得檢測(cè)結(jié)果直觀，正成為今后微生物檢測(cè)發(fā)展的一個(gè)主要發(fā)展方向。

2.3.2 常規(guī)的致病微生物檢測(cè)技術(shù)

不同病原體的化學(xué)組成或所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各異，利用微生物（主要是細(xì)菌）的不同生化和生理特性，可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。生化鑒定是檢測(cè)細(xì)菌最常用的方法。

2.4 以免疫學(xué)方法建立的快速檢測(cè)技術(shù)

免疫檢測(cè)的基本原理是抗原抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。不同的微生物有其特異的抗原，并能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體。在免疫檢測(cè)中，可利用單克隆抗體檢測(cè)微生物的特異抗原，也可利用微生物抗原檢測(cè)體內(nèi)產(chǎn)生的特異抗體，兩種方法均能判斷機(jī)體的感染狀況。

2.4.1 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence Technique）是用熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)抗原或抗體的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)。所用的熒光素標(biāo)記抗體通稱為熒光抗體，免疫熒光技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測(cè)樣品上直接滴加己知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加己知的細(xì)菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。

2.4.2 酶免疫測(cè)定技術(shù)

酶免疫測(cè)定（Enzyme immunoassay, EIA）根據(jù)抗原抗體反應(yīng)是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物而分為均相和非均相兩種類(lèi)型。非均相法較常用，包括液相免疫測(cè)定法與固相免疫測(cè)定法。固相免疫測(cè)定法的代表技術(shù)是ELISA。ELISA 技術(shù)是抗原或抗體吸附到固相載體上作為一種試劑來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原的一種方法。根據(jù)反應(yīng)原理，加入某種酶標(biāo)記的抗體或抗原，洗滌除去未結(jié)合物，加入該酶的底物，酶催化底物生成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物的量有關(guān)，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺可定量測(cè)定。

2.4.3 免疫印跡技術(shù)

免疫印跡（Immunoblot）法分三個(gè)步驟：第一，SDS 聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二，電轉(zhuǎn)移。目的是將凝膠中己分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第三，酶免疫定位，該步的意義是將前兩步中己分離，但肉眼不能見(jiàn)到的抗原帶顯示出來(lái)。將印有蛋白抗原條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)后，再與能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物作用，最終使區(qū)帶染色。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA 的高敏感性和高特異性，是一種有效的分析手段。

2.4.4 免疫組織化學(xué)方法

免疫組織化學(xué)方法是應(yīng)用免疫學(xué)中的抗原抗體反應(yīng)，借助可見(jiàn)的標(biāo)記物，在組織原位顯示抗原或抗體的方法。常用的免疫組織化學(xué)方法有熒光免疫和酶免疫組化技術(shù)、金標(biāo)免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫電鏡，該技術(shù)特點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞涂片、印片、組織切片進(jìn)行處理和染色鏡檢。免疫組化技術(shù)彌補(bǔ)了上述血清學(xué)診斷方法的不足，使得在細(xì)胞或組織內(nèi)檢測(cè)病原微生物成分成為可能。對(duì)于在宿主組織液中微量表達(dá)或不表達(dá)抗原、抗體的微生物，免疫組化具有較好的輔助診斷價(jià)值。利用免疫組化技術(shù)，還能觀察被侵犯組織致病微生物繁殖和對(duì)組織破壞情況。

2.5 活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)

自動(dòng)旋轉(zhuǎn)平板和激光菌落掃描計(jì)數(shù)法，在均勻薄層瓊脂營(yíng)養(yǎng)基表面，以阿基米德螺旋線方式將液體樣品從中心到邊緣均勻涂在平板上。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)在計(jì)數(shù)格區(qū)間內(nèi)計(jì)數(shù)，或用激光計(jì)數(shù)器來(lái)掃描平板，以透過(guò)光的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)菌落的存在。

PetrifiumTM系統(tǒng)用可重新水化的營(yíng)養(yǎng)成分取代瓊脂傾注平板。把這種營(yíng)養(yǎng)成分和一種膠態(tài)試劑一起嵌入在一系列薄膜上。取1mL液體樣品滴于膜系統(tǒng)中央，重新水化的培養(yǎng)基便可作為微生物生長(zhǎng)的支持物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，便可像常規(guī)平皿計(jì)數(shù)一樣直接在膜系統(tǒng)上對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。Petrifium2000系列從菌群鑒定到結(jié)束只需培養(yǎng)8h。

Redigel系統(tǒng)（RCR Scientific）由多種營(yíng)養(yǎng)成分與果膠混合并裝入試管，混勻后無(wú)需溶解凝膠。試樣直接加入試管后倒入覆蓋有一層鈣質(zhì)的培養(yǎng)皿中，倒入液體與鈣質(zhì)形成果膠鈣。培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

疏水網(wǎng)膜（HGMF）技術(shù)是常規(guī)平皿劃線方法的改進(jìn)。樣品用疏水網(wǎng)膜過(guò)濾，要檢測(cè)的微生物被捕獲在疏水網(wǎng)膜的小格中。在接種后的疏水網(wǎng)膜上傾入適當(dāng)?shù)沫傊?，在適當(dāng)時(shí)間培養(yǎng)后即可計(jì)數(shù)。由于菌落都是正方形，人工或機(jī)械計(jì)數(shù)都很方便?？捎糜诮湍负兔咕?jì)數(shù)、沙門(mén)氏菌檢測(cè)、大腸桿菌/大腸菌群檢測(cè)。

2.6 PCR檢測(cè)技術(shù)在食品病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)由于其高度敏感性、特異性等特點(diǎn)使其在食品微生物檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用，而且由此衍生出了多種方法進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)在經(jīng)常應(yīng)用的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR等，它們都是針對(duì)于食品中病原菌的特異性靶基因，通常是致病基因進(jìn)行檢測(cè)。PCR技術(shù)和其它檢測(cè)技術(shù)(如核酸雜交等)聯(lián)合應(yīng)用，展現(xiàn)了良好的前景。最新發(fā)展的熒光定量PCR技術(shù)更能檢測(cè)樣品中病原菌的數(shù)量，如對(duì)李氏桿菌[3]、沙門(mén)氏菌[4]、肉毒桿菌[5]、大腸桿菌O157∶H 7[6]等的檢測(cè)也都取得了良好效果。

2.7 生物芯片技術(shù)在食品病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[7]

生物芯片技術(shù)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)綜合性的高新技術(shù)，它以微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)和生物技術(shù)為依托，將生命科學(xué)研究中的許多不連續(xù)過(guò)程（如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測(cè)等步驟）集成并移植到一塊普通郵票大小的芯片上去，并使這些分散的過(guò)程連續(xù)化、微型化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量生物信息進(jìn)行快速、并行處理的要求。基因芯片具有高通量能并行檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),僅靠一個(gè)實(shí)驗(yàn)就能檢測(cè)出大量的未知菌，所以基因芯片技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域的成功經(jīng)驗(yàn)為其應(yīng)用于食品微生物特別是致病菌的檢測(cè)打下了基礎(chǔ)[7，8]。

2.8 傳感器技術(shù)在食品病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

生物傳感器主要是將生物、化學(xué)、熱變化、光效應(yīng)、質(zhì)量信號(hào)等轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的技術(shù)。目前已經(jīng)商品化的傳感器有酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、微生物傳感器、DNA雜交傳感器、細(xì)胞器傳感器、仿生傳感器、分子印跡傳感器等。光纖DNA生物傳感器是DNA生物傳感器中發(fā)展最晚，技術(shù)最新的一類(lèi)，它的作用機(jī)理是利用石英的表面特性先接上一個(gè)連接物，然后將ssDNA或cDNA連接在光纖端面上，與目的基因進(jìn)行雜交，雜交后的雙鏈DNA經(jīng)雜交嵌合劑產(chǎn)生的光效應(yīng)而被檢測(cè)。目前光纖傳感器已經(jīng)應(yīng)用到了測(cè)定污染食品中的大腸桿菌O157∶H 7、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌中。

2.9 流式細(xì)胞術(shù)FCM 在食品病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

該技術(shù)是用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行自動(dòng)快速定量分析和分選的新技術(shù)，具有速度快、精確度高、記數(shù)細(xì)胞量大以及參數(shù)分析等全面測(cè)量細(xì)胞和分選細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。由于FCM 檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與DNA片段的大小成比例，根據(jù)熒光濃度的直方圖就可知道細(xì)菌的DNA指紋圖譜，從而確定細(xì)菌的種類(lèi)?，F(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)能夠檢測(cè)純化的DNA可達(dá)pg級(jí)水平，在10min內(nèi)可以完成數(shù)據(jù)的收集和分析。近年來(lái)在臨床實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)逐步用于病毒、細(xì)菌的檢測(cè)、計(jì)數(shù)、鑒定等。FCM 目前已經(jīng)發(fā)展到可測(cè)定DNA片段的大小，被認(rèn)為是一種鑒定細(xì)菌很有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。另外FCM 結(jié)合免疫熒光抗體檢測(cè)技術(shù)更能促進(jìn)病原菌的特異性快速檢測(cè)。

2.10 基因探針技術(shù)在食品病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

該技術(shù)是從細(xì)菌中提取各自穩(wěn)定、特異的DNA片段，經(jīng)克隆提純，再將此DNA片段標(biāo)記上可檢測(cè)的指示劑，如放射性同位素、熒光物質(zhì)等使之成為特異性的DNA探針。細(xì)菌經(jīng)過(guò)處理后固定于另一固相表面上，經(jīng)洗滌加入DNA探針進(jìn)行雜交，DNA探針可以與同源性的靶DNA進(jìn)行互補(bǔ)性結(jié)合，依據(jù)指示劑不同,選用合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。而且選用這個(gè)技術(shù)可以進(jìn)行菌種和毒種鑒別。

最近又設(shè)計(jì)了一種DNA 指紋圖譜自動(dòng)分析系統(tǒng)——Ribo PrinterTM(Dupont de Nemours公司產(chǎn)品）。具體操作是從細(xì)菌細(xì)胞中提取DNA,接著用限制性酶將DNA降解成片段，DNA片段通過(guò)電泳得到分開(kāi)， 再轉(zhuǎn)移至雜交膜上與DNA探針雜交。由于引入了化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，雜交片段發(fā)出的光線被相機(jī)捕獲，得到的核酸圖譜與其他貯存的DNA核酸堿基序列進(jìn)行比較，通過(guò)核酸匹配分析可以對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。

微生物在食品中存在著很大的不安全性，會(huì)產(chǎn)生很多不安全因素，因此對(duì)食品中病原菌的快速檢測(cè)有著十分重要的意義。

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