流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健康成年人淋巴細(xì)胞亞群

趙鵬飛，陳坤，趙要順，藺 強(qiáng) ，湯桂梅

（華北油田總醫(yī)院腫瘤科，河北任丘 ，062552）

隨著艾滋病、自身免疫病及各種腫瘤的發(fā)病率的上升，人們對(duì)這些疾病的發(fā)病機(jī)理、病程發(fā)展、治療效果進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)生與機(jī)體免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。淋巴細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)和執(zhí)行免疫功能的主要細(xì)胞群體。進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，對(duì)于了解機(jī)體免疫功能狀態(tài)有重要的臨床意義。淋巴細(xì)胞受生態(tài)環(huán)境、社會(huì)經(jīng)濟(jì)等多種因素影響，不同地區(qū)、不同種族存在差異，國(guó)內(nèi)、國(guó)外近年來(lái)不斷調(diào)查研究，紛紛建立本國(guó)或本地區(qū)的健康人群參考范圍［1］。健康人群外周血淋巴細(xì)胞亞群正常參考范圍建立，是監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的基礎(chǔ)，對(duì)疾病診斷分期、治療評(píng)價(jià)、預(yù)后判斷有重要指導(dǎo)意義。我們就這一問(wèn)題綜述如下：

1 淋巴細(xì)胞檢測(cè)方法［2］

1.1 形態(tài)學(xué)觀察

依據(jù)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)特征，借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：方法學(xué)較簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，準(zhǔn)確性差。

1.2 放射性核素（3H-TdR）摻入法

增殖的細(xì)胞胞內(nèi)新合成DNA需攝取核苷酸原料，應(yīng)用核素標(biāo)記的核苷酸參與反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性強(qiáng)度可反映淋巴細(xì)胞增殖水平。優(yōu)點(diǎn)：靈敏，可自動(dòng)操作。缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，存在放射污染危險(xiǎn)。

1.3 MTT比色法

活細(xì)胞內(nèi)有活性的線粒體作用于MTT，可生成藍(lán)色甲產(chǎn)物，其生成量與細(xì)胞代謝活躍程度呈正比，通過(guò)比色可間接定量分析細(xì)胞增殖水平。此方法敏感，經(jīng)濟(jì)，無(wú)放射性污染，但重復(fù)性差。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞儀結(jié)合現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)，可同時(shí)鑒別單個(gè)細(xì)胞上的多種參數(shù)定量定性分析，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。

流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞免疫表型分析已逐漸成為臨床檢驗(yàn)的常規(guī)工作之一，在各地區(qū)廣泛使用［3］。

2 淋巴細(xì)胞亞群分析

利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，再配合多色熒光染料，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開(kāi)來(lái)，進(jìn)而得到各亞群的相對(duì)比例。最常檢測(cè)的亞群包括T細(xì)胞（CD3）、B細(xì)胞（CD19）、NK細(xì)胞（CD16+56）、輔助性T細(xì)胞（CD3+CD4+）和抑制性T細(xì)胞（CD3+CD8+）等等。

2.1

T淋巴細(xì)胞反映細(xì)胞免疫功能，免疫缺陷和自身免疫性疾病與T淋巴細(xì)胞的含量有著緊密聯(lián)系。CD3是T細(xì)胞的特異性抗原，可用CD3來(lái)區(qū)分全部T細(xì)胞。根據(jù)各亞群的特異性志，T淋巴細(xì)胞可分為CD3/CD4雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD3/CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞，CD3/CD4雙陽(yáng)T細(xì)胞即輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞，具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，是HIV病毒感染的主要對(duì)象，CD4受體是HIV病毒入侵的主要途徑。因此CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)被用于評(píng)價(jià)HIV感染后免疫系統(tǒng)受損的程度［4］。CD3/CD8雙陽(yáng)T細(xì)胞即抑制/細(xì)胞胞毒性T細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞免疫及體液免疫的功能，以及殺傷靶細(xì)胞的功能。 CD4/CD8的比值用于評(píng)價(jià)自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)以及免疫缺陷病患者的免疫狀態(tài)，在器官移植后免疫重建、移植后免疫監(jiān)測(cè)以及實(shí)體腫瘤療效觀察中有重要臨床意義。

2.2

B淋細(xì)胞通過(guò)表面的CD19抗原可以從淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)。通過(guò)產(chǎn)生各種自身抗體、抗細(xì)菌抗體及致病性抗體，發(fā)揮體液免疫功能，從而維持機(jī)體自身穩(wěn)定。

2.3

NK細(xì)胞是不同于T、B淋巴細(xì)胞，具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的一類淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞殺傷效應(yīng)的靶細(xì)胞有腫瘤細(xì)胞、病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞以及機(jī)體某些正常細(xì)胞，具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能，從而行使免疫監(jiān)視功能，在抑瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面起重要作用［5］。

3. 淋巴細(xì)胞亞群差異

3.1 地區(qū)差異

各地區(qū)的生活環(huán)境、生存條件、遺傳因素不同，各地區(qū)正常人群淋巴細(xì)胞亞群存在差異。 Klose等研究比較發(fā)現(xiàn)，德國(guó)布基那法索地區(qū)、新加坡和坦桑尼亞地區(qū)正常成年人T細(xì)胞絕對(duì)值(1801cells/ul vs.1550cells/ul vs. 1431cells/ ul )、B細(xì)胞絕對(duì)值（349cells/ul vs. 335cells/ul vs.253cells/ul）及CD4+T細(xì)胞（1082cells/ul vs. 814cells/ul vs. 833cells/ul).有顯著差異［6］。Vithavasai等研究發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)人CD3+、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值、百分?jǐn)?shù)明顯低于高加索人［7］。國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道中，與高加索人和美國(guó)人相比，中國(guó)人的CD3+CD8+細(xì)胞和NK細(xì)胞(CD3-，CD16+和/或CD56+)的相對(duì)值(百分率)與絕對(duì)值均高，CD3-CD19+細(xì)胞和CD3+CD4+細(xì)胞僅相對(duì)值較低，但絕對(duì)值不少.CD4+/CD8+比值向低值漂移［8］。浙江省與北京地區(qū)健康成年人相比，T細(xì)胞絕對(duì)值（1539cells/ul vs.1907cells/ul；P ≤ 0.005)有顯著差異［9］，這種差異也存在于國(guó)內(nèi)其它地區(qū)［10］［11］［12］。因此在不同地區(qū)應(yīng)建立本地區(qū)統(tǒng)一的正常參考值范圍。

3.2 年齡差異

隨著年齡增長(zhǎng)，正常人群淋巴細(xì)胞各亞群也相應(yīng)發(fā)生變化。Bisset等研究發(fā)現(xiàn)，年輕組(＜50歲)與老年組(＞50歲)相比，T細(xì)胞百分比 (73.45% vs.69.20%; P ≤ 0.05)、絕對(duì)值(1257 cells/ul vs. 996 cells/ul; P ≤ 0.005)、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值(737 cells/ul vs.653 cells/ul; P ≤0.05)、CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值(439 cells/ul vs.302 cells/ul; P ≤ 0.005)有顯著差異［13］。焦陽(yáng)等研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)人群不同年齡組淋巴細(xì)胞亞群存在較大差異。青年組（19-44歲）、中年組（45-64歲）、老年組（＞65歲）三組相比，B細(xì)胞絕對(duì)值、T細(xì)胞絕對(duì)值、CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值有顯著差異［14］。

3.3 性別差異

Uppal等研究發(fā)現(xiàn)在印度成年人中，女性CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值及CD4+T百分比高于男性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ≤0.05），男性CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值高于女性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.01）［15］。Choong 等研究發(fā)現(xiàn)在馬來(lái)西亞華人中，女性CD4+/+CD8+比值顯著高于男性［16］。吳引偉等研究發(fā)現(xiàn)男女之間CD3+、CD3+CD4+及CD3-CD(16+56)+細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(P＜0.01)［11］。郭志偉等研究發(fā)現(xiàn)男性和女性的CD3+的百分率和CD3+CD4+百分率和絕對(duì)數(shù)均有差異，表現(xiàn)為女性高于男性。而CD3+絕對(duì)數(shù)和CD3+CD8+百分率和絕對(duì)數(shù)沒(méi)有性別差異［9］。寧鐵林等研究發(fā)現(xiàn)天津地區(qū)成年人CD4細(xì)胞在不同性別、年齡間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)［17］，陳霞等研究發(fā)現(xiàn)樂(lè)山地區(qū)健康成年人CD3、CD4在性別和年齡上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［18］。

3.4 民族差異

在同一地區(qū)，不同民族之間也存在著差異。張琰等研究75例維吾爾族和104例漢族健康成人發(fā)現(xiàn)，兩民族在輔助性T細(xì)胞水平、NK細(xì)胞、B細(xì)胞上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;維吾爾族與漢族男性在輔助性T細(xì)胞及CD4/CD8比值上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，前者略低于后者;維吾爾族女性NK細(xì)胞顯著高于漢族(P＜0.01)［19］，劉帥鳳等研究發(fā)現(xiàn)CD4和CD4/CD8在民族分布上(漢族79名、壯族31名)的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)［20］。衛(wèi)大英等研究彝族［21］、賀健梅等研究苗族［22］、段松等研究傣族［23］發(fā)現(xiàn)，各族健康成年人CD4在絕對(duì)數(shù)上無(wú)明顯民族差異。

隨著流式細(xì)胞儀的廣泛使用以及生物技術(shù)的深入進(jìn)展，對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群的分群和功能有了更深入的了解。建立健康成年人外周血淋巴細(xì)胞亞群正常參考值范圍，是進(jìn)行病人免疫功能監(jiān)測(cè)、研究病人免疫功能變化的基礎(chǔ)工作，美國(guó)［24］、意大利［25］、土耳其［26］等國(guó)已經(jīng)建立了本國(guó)統(tǒng)一的淋巴細(xì)胞亞群參考值范圍，其中意大利全國(guó)53個(gè)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室參加，調(diào)查了1311名人群，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，使調(diào)查結(jié)果具代表性、準(zhǔn)確性和權(quán)威性。我國(guó)一些地區(qū)也進(jìn)行了本地區(qū)淋巴細(xì)胞正常參考值調(diào)查，但在儀器使用、人員操作、抗體使用、樣本選擇上沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此在結(jié)果上缺乏代表性、可比性。我們期待在全國(guó)有組織地選取多個(gè)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)格按照SENIEUR原則［27］選取大樣本，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，充分考慮地區(qū)、年齡、性別和民族差異，及早建立具中國(guó)代表性、準(zhǔn)確性和權(quán)威性的淋巴細(xì)胞亞群正常參考值范圍，為我國(guó)臨床疾病的診治及治療提供客觀依據(jù)，從而確定我國(guó)艾滋病分期及診治標(biāo)準(zhǔn)。

[1]王建中，臨床流式細(xì)胞分析，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002，74

[2]龔非力，醫(yī)學(xué)免疫學(xué)，科學(xué)出版社，2004，403

[3]Bleesing J J，F(xiàn)leisher TA.Immunophenotyping.Semin Hematol，2001，38:100-110

[4]Stewart C C，Nicholson JK.Immunophenotypping.New York:A John Wiley&Sons，Inc.，Publication，2000，83-261

[5]任歡，張宇陽(yáng)，CD3+CD56+T細(xì)胞的免疫學(xué)特性及抗腫瘤作用.國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，1999,22(3):123-127

[6]Klose N,Coulibaly B,Tebit DM,et al.Immunohematological referance values for healthy adults in Burkina Faso.Clin Vaccine Immunol,2007 Jun;14(6):775-781

[7]Vithavasai V,Sirisanthana T,Sakonwansun C, et al.Flow cytometric analysis of T-lymphocytes subsets in adult Thais.Asian Pac I Allergy Immunol,1997 sep;15(3): 141-146

[8]朱立華，王建中，中國(guó)人血液淋巴細(xì)胞免疫表型參考值調(diào)查，中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1998(4)223-226

[9]郭志宏，姚亞萍，李西婷等，浙江地區(qū)健康青少年和成人外周血T淋巴細(xì)胞免疫表型調(diào)查及正常參考值范圍的建立，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008 9(1)32-35

[10]李杰，劉楚鈿，鄢心革等，405名廣東省籍健康成人外周血淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)分析，華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008 34(1)30-33

[11]吳引偉，王建芳，李敏等，南京地區(qū)健康成年人外周淋巴細(xì)胞亞群正常值調(diào)查，醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2004 17(3)363-364

[12]蔣衛(wèi)民，潘孝彰，康來(lái)儀等，上海地區(qū)成人不同年齡組間CD4、CD8淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)正常值調(diào)查，中華傳染病雜志，2002 20(4)203-205

[13]Bisset L R,Lung T L,Kaelin M,et al.Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland.Eur J Haematol,.2004,72:203—212

[14]Jiao Y,Qiu Z,Xie J,et al.Reference ranges and age-related changes of peripheral blood lymphocyte subsets in Chinese healthy adults.Science in China (series C:Life Sciences)2009,07:643-650

[15]Uppal SS,Verma S,Dhot PS,et al.ormal values of CD4 and CD8 lymphocyte subsets in healthy Indian adults and the effects of sex,age,ethnicity and smoking.Cytometry B CLIN Cytom,2003 Mar;52(1):32-36

[16]Choong ML,Ton Sh,Cheong Sk,et al.Influence of race,age and sex on the lymphocyte subsets in peripheral blood of healthy Malaysian adults.Ann Clin Biochem,1995 Nov32 (6);532-539

[17]寧鐵林，朱效科，鄭敏娜等，天津地區(qū)健康人外周血CD4、CD8淋巴細(xì)胞正常參考值研究，中國(guó)慢性病預(yù)防與控制，2007 15(5)432-434

[18]陳霞，李娜，牟懷德等，樂(lè)山地區(qū)健康成人CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)參考值調(diào)查，現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007 34(23)4413-4414，4419

[19]張琰，溫浩，張朝霞等，新疆地區(qū)維吾爾族和漢族血液淋巴細(xì)胞免疫表型參考值范圍的調(diào)查，中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006 14(1)133-136

[20]劉帥鳳，劉偉，陳杰等，廣西壯族自治區(qū)健康成年人T淋巴細(xì)胞亞群分類絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4/CD8比值調(diào)查，中國(guó)艾滋病性病，2004(6)413-415

[21]賀健梅，鄒瀟白，彭瑾瑜等，湖南省苗族健康人群外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞正常參考值研究，中國(guó)感染控制雜志，2009 8(2)82-85

[22]衛(wèi)大英，馬名駒，馬志凌等，彝族健康人群外周T淋巴細(xì)胞正常參考值研究，現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007 34(3)416-418

[23]段松，項(xiàng)麗芬，馬羅云等，健康傣族人CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)正常值調(diào)查，中國(guó)艾滋病性病2007 13(5)424-426

[24]NCCLS.Clinical applications of flow cytometry:quality assurance and immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes.NCCLS Document H42-T,1992,12:1-15

[25]Santagostine A,Garbaccio G,Pistorio A et al,An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults.Haematoloica,1999 Jun;84(6):499-504

[26]Yaman A,Cetiner S,Kibar F,et al.Reference ranges of lymphocyte subsets of healthy adults in Turkey.Med Prioc Pract,2005 May-Jun;14(3):189-193

[27]Ligthart GJ,Corberand JX,Geertzen HGM,et al.Necessity of the assessment of health status in human immunogerontological studies:evaluation of the SENIEUR protocol.Mech Ageing Dev.1990; 55:89-105