原核表達(dá)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)建活載體疫苗的研究進(jìn)展

韋志強(qiáng)

（四川省成都市溫江區(qū)農(nóng)村發(fā)展局，四川 成都 611130）

1 免疫預(yù)防現(xiàn)狀

目前在生產(chǎn)上應(yīng)用的主要是商品化弱毒苗，幾種商品化弱毒苗在減少PRRS疾病損失方面發(fā)揮了一定的作用，但PRRS疫苗的使用仍然存在著不少問(wèn)題:（1）疫苗毒能在豬體內(nèi)持續(xù)性存在，能從免疫豬傳給非免疫豬，從免疫豬群傳到非免疫豬群，公豬免疫后可通過(guò)精液傳播，母豬免疫后可經(jīng)胎盤造成胎兒的先天性感染；（2）血清型不同時(shí)，保護(hù)作用不完全，且持續(xù)時(shí)間較短，對(duì)于新出現(xiàn)的超強(qiáng)毒株則完全無(wú)保護(hù)作用；（3）疫苗免疫后并不能明顯減少?gòu)?qiáng)毒株在豬群內(nèi)的傳播；（4）疫苗毒能返強(qiáng)而致病，免疫后抗體水平低下時(shí)，有誘發(fā)ADE作用的可能，反而使病情加劇。因此，對(duì)于PRRS弱毒疫苗應(yīng)采取謹(jǐn)慎使用的態(tài)度，研制高效安全的疫苗乃當(dāng)務(wù)之急。

2 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白及活載體疫苗開(kāi)發(fā)

隨著新型疫苗的不斷涌現(xiàn)，PRRS活載體疫苗也逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)?；钶d體疫苗主要針對(duì)PRRSV的三種主要結(jié)構(gòu)蛋白:GP5/E蛋白（囊膜糖蛋白）、ORF6編碼膜基質(zhì)蛋白（M蛋白）及OFR7編碼核衣殼蛋白（N蛋白）。

2.1 GP5/E蛋白 PRRSV E基因長(zhǎng)603 bp左右，編碼GP5糖基化包膜蛋白（又稱E蛋白），在所有結(jié)構(gòu)蛋白中是變異程度最高的一種蛋白，但GP5是重要的抗原保護(hù)性蛋白，能誘導(dǎo)高滴度的中和性抗體，具有最強(qiáng)的中和能力，在保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Rodrigue等研究缺失跨膜區(qū)的GP5基因在大腸桿菌中獲得良好的表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物可與PRRS陽(yáng)性血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。Gonin等將PRRSV-GP5克隆到融合有GST蛋白基因的pGEx-4T-1載體中，結(jié)果其表達(dá)產(chǎn)物可用于病毒血清學(xué)檢測(cè)。谷紅等將中國(guó)分離的BJ-4株缺失N端疏水序列的PRRSV-dGP5克隆到原核高效表達(dá)載體pGEX-4T-2中，在E.coli BL21細(xì)胞中成功表達(dá)了重組蛋白GST-dGP5，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，表達(dá)量為20.8%，利用融合肽進(jìn)行親和層析得到高純度的重組蛋白。陳建君等將中國(guó)GD株GP5克隆到原核表達(dá)載體pBAD/g III C中，將該片段定向插入到轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌中，重組質(zhì)粒用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，用Western blotting鑒定表達(dá)蛋白，結(jié)果證明GP5基因得到表達(dá)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者雖然已對(duì)E蛋白的本質(zhì)及其原核表達(dá)、免疫反應(yīng)特征、在保護(hù)性免疫中的作用等方面進(jìn)行了大量的研究工作，并取得了較大的進(jìn)展，但仍有很多方面尚不十分明確。

2.2 ORF6編碼的非糖基化蛋白（M蛋白） ORF6基因長(zhǎng)525bp左右，編碼M蛋白，具有高度保守性。在所有蛋白中M蛋白刺激引起的T細(xì)胞增殖反應(yīng)最為強(qiáng)烈，可見(jiàn)M蛋白與PRRSV誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫有關(guān)。另外，M蛋白上至少存在4個(gè)線性抗原表位和3個(gè)構(gòu)象性表位，能誘導(dǎo)低滴度的中和抗體產(chǎn)生，這對(duì)PRRSV基因工程疫苗的設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。王嬌等采用原核表達(dá)載體pET-32a（+）表達(dá)了河北地方珠PRRSV-ORF6蛋白，經(jīng)Western-blotting分析表明，表達(dá)蛋白與陽(yáng)性血清發(fā)生了特異性反應(yīng)。綜合這些研究結(jié)果，一方面可以利用該原核表達(dá)產(chǎn)物建立反映機(jī)體抗體水平的特異性診斷方法；另一方面，該特異性抗體的制備對(duì)以M蛋白為基礎(chǔ)的PRRSV新型基因工程疫苗的研制以及對(duì)疫苗激發(fā)免疫反應(yīng)的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)材料。

2.3 ORF7編碼核衣殼蛋白（N蛋白） N基因及其編碼蛋白長(zhǎng)372bp左右，主要編碼核衣殼蛋白，是一種堿性磷酸蛋白，N蛋白和M蛋白一樣具有高度保守性，N蛋白的抗原位點(diǎn)分散于整個(gè)N蛋白上，沒(méi)有一個(gè)N蛋白氨基酸片段能模擬完整N蛋白的抗原性，且美洲型毒株和歐洲型毒株的N蛋白上存在著能發(fā)生交叉反應(yīng)的保守性抗原位點(diǎn)，同時(shí)也存在著不同反應(yīng)性的特異性抗原表位，這些針對(duì)共同抗原表位的特異性單抗，對(duì)于PRRSV的診斷以及鑒別美洲型和歐洲型PRRSV感染均具有重要意義。與其他蛋白相比，N蛋白激發(fā)的體液免疫反應(yīng)最強(qiáng)，機(jī)體產(chǎn)生的PRRSV抗體主要是針對(duì)N蛋白的。另外，豬感染PRRSV后，針對(duì)各種結(jié)構(gòu)蛋白的抗體成分的出現(xiàn)時(shí)間不同，而N蛋白抗體出現(xiàn)較早，最早于感染后一周即可檢出N蛋白抗體，且N蛋白抗體維持時(shí)間較長(zhǎng)，其下降速度也明顯慢于M和GP5抗體。因此，N蛋白可作為診斷抗原用于PRRS的抗體檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用此原理對(duì)ORF7基因進(jìn)行了原核高效表達(dá)，以達(dá)到診斷應(yīng)用的要求。夏平安等將N蛋白基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-N，用Western blotting分析純化后的融合蛋白，結(jié)果顯示出良好的生物學(xué)活性；再利用純化融合蛋白作包被抗原，同時(shí)優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了可檢測(cè)抗PRRSV N蛋白抗體的間接ELISA方法（N-ELISA），并將所建立的N-ELISA與國(guó)外進(jìn)口的PRRS檢測(cè)試劑盒IDEXX-ELISA同時(shí)對(duì)200份臨床送檢血清進(jìn)行平行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性符合率為92.7%，表明本試驗(yàn)建立的N-ELISA與IDEXX-ELISA具有同樣高的特異性。

3 結(jié)語(yǔ)

目前國(guó)內(nèi)外的研究顯示原核表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，并經(jīng)體外試驗(yàn)檢測(cè)，所表達(dá)的蛋白抗原具有很好的免疫原性，這對(duì)開(kāi)發(fā)研制新型的高效免疫疫苗及診斷方法具有重要意義。

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