微生物脂肪酶概況及其動物營養(yǎng)效應(yīng)的研究進(jìn)展

葉 慧 雷建平 左建軍 馮定遠(yuǎn)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642)

脂肪酶（EC3.1.1.3）是廣泛存在于各類動物、植物和微生物中的一種酶,在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用,具有顯著的生理意義和生產(chǎn)應(yīng)用的潛能（Jaeger等，1994；Gupta等，2004）。微生物來源的脂肪酶含量最為豐富，包括細(xì)菌、霉菌和酵母來源的。由于微生物種類多、繁殖快，易發(fā)生遺傳變異，產(chǎn)生的脂肪酶具有比動植物脂肪酶作用更廣的pH值、反應(yīng)溫度范圍以及底物專一性；而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和樣品提純，因此，微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，是生物技術(shù)和有機(jī)化學(xué)應(yīng)用中使用最為廣泛的酶類之一。雖然許多研究者在通過微生物篩選獲取優(yōu)質(zhì)的脂肪酶方面已取得令人滿意的結(jié)果，但有學(xué)者認(rèn)為，在不久的將來，使用基因工程菌生產(chǎn)脂肪酶將占主導(dǎo)地位，因?yàn)楣こ叹鷮?shí)現(xiàn)為特定應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)適合的具有顯著特性的脂肪酶（Treichel等，2010）。

相對于植物和動物源脂肪酶而言，微生物脂肪酶更適合作為飼料添加劑作用于動物腸道，促進(jìn)動物腸道內(nèi)脂質(zhì)消化和吸收。以動物腸道作為酶反應(yīng)場所，其環(huán)境既具有穩(wěn)定性又有不可控性，特定動物的消化道其特定部位的pH值、溫度基本是穩(wěn)定的，但動物生理狀態(tài)和日糧品種等許多因素不可控，為此，需要選擇合適的脂肪酶應(yīng)用于動物日糧。

1 微生物脂肪酶概況

1.1 產(chǎn)脂肪酶的微生物來源

地球大約2%的微生物可以產(chǎn)生脂肪酶（Hasan等，2006）。Sharma等（2001）統(tǒng)計(jì)產(chǎn)脂肪酶的微生物共33個屬，其中革蘭氏陽性菌來源的7個屬，30種菌；革蘭氏陰性菌來源的4個屬，17種菌；霉菌來源的14個屬，42種菌；酵母來源的7個屬，20種菌；放線菌類來源的1個屬，5種菌。由于微生物的多樣性，我們相信產(chǎn)脂肪酶的微生物遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這個數(shù)目。

雖然脂肪酶的菌源很多，但可應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)的野生菌或其重組型卻是少數(shù)，其中重要的種類有：無色桿菌、產(chǎn)堿桿菌、節(jié)桿菌、芽孢桿菌、伯克氏菌、色素桿菌和假單胞菌（Jaeger等，1994；Palekar等，2000）。目前大多數(shù)商品脂肪酶產(chǎn)酶菌都屬于根霉屬、曲霉屬、青霉屬、地霉屬、毛霉屬和根毛霉屬(Treichel等，2010)。

1.2 微生物脂肪酶特性

微生物脂肪酶是作用在油-水界面的絲氨酸水解酶。其催化三聯(lián)體是由Ser-Asp/Glu-His組成，通常在絲氨酸活性部位周圍擁有共同序列(Gly-x-Ser-x-Gly)。脂肪酶的三維立體結(jié)果顯示了α或β水解酶折疊的性質(zhì)(Nadine等，1999)。脂肪酶在水相和非水相的界面催化酯鍵水解，這是脂肪酶和酯酶的不同之處（Panzanaro等，2010）。除此之外，脂肪酶還有多種酶活性，如催化多種酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換(Jaeger等,1999)。微生物脂肪酶的各種特性主要包括分子量、最適pH值、最適溫度、穩(wěn)定性和底物特異性等方面，這些酶學(xué)特性已有大量文獻(xiàn)進(jìn)行闡述(Dharmsthiti等,1998;Pratuangdejkul等，2000；Snellman等,2002；Mahadik 等,2004;Mhetras等,2009)。

Gupta等（2004）把微生物脂肪酶分為3大類：即非特異性、特異選擇性和底物特異性基礎(chǔ)上的脂肪酶。非特異性脂肪酶隨機(jī)作用于甘油三酯分子，甘油三酯被完全水解為脂肪酸和甘油。與此相反，特異性脂肪酶是1，3位特異性脂肪酶，只水解甘油三酯C1和C3酯鍵，從而產(chǎn)生游離脂肪酸、1，2-甘油二酯、2，3-甘油二酯和2-甘油單酯。細(xì)菌胞外脂肪酶是特異性脂肪酶。第三類脂肪酶包含脂肪酸特異性脂肪酶，它表現(xiàn)為明顯的脂肪酸優(yōu)先水解性。

2 外源脂肪酶在動物消化道的營養(yǎng)效應(yīng)及作用機(jī)理

酶制劑的營養(yǎng)效應(yīng)，是由于酶制劑直接作用于水解底物，從而產(chǎn)生一系列生理生化的變化，直接或間接地對動物產(chǎn)生的營養(yǎng)作用。關(guān)于酶制劑在動物體內(nèi)發(fā)揮的營養(yǎng)效應(yīng)，是與許多不同的底物協(xié)同起來產(chǎn)生作用的，酶制劑在腸道內(nèi)的間接作用有時(shí)比其直接作用更為重要。酶制劑跟不同底物搭配具有不同的營養(yǎng)效應(yīng)。

早在20世紀(jì)八、九十年代，國外就已經(jīng)有學(xué)者研究脂肪酶在飼料中的應(yīng)用，但由于動物胰脂肪酶的提純技術(shù)還不夠完善，導(dǎo)致脂肪酶中可能摻雜一些雜質(zhì)，如CCK等，導(dǎo)致出現(xiàn)畜禽日糧中添加脂肪酶降低了采食量和生產(chǎn)性能的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了脂肪酶在飼料中的應(yīng)用（Al-Marzooqi等，1999、2000）。Polin 等（1980）給白來航公雞飼以含4%動物油的玉米基礎(chǔ)日糧，研究了豬胰脂肪酶粗提物與膽汁鹽對脂肪消化的影響，在添加和不添加0.4%膽汁酸的情況下，孵化后第2～9 d添加0.1%的脂肪酶均能提高脂肪的吸收，但效果不顯著。主要原因是在酸性條件下，豬胰脂肪酶容易失活，當(dāng)其到達(dá)主要作用位點(diǎn)(十二指腸)時(shí)其活力已經(jīng)相當(dāng)?shù)土耍⑶邑i胰脂肪酶活性的發(fā)揮依賴于輔脂酶及膽汁鹽的存在。如果脂肪酶能夠耐酸，且其活力不依賴于輔脂酶及膽汁鹽，那么從理論上說將其添加到日糧中應(yīng)該能夠提高脂肪的消化。

2.1 彌補(bǔ)內(nèi)源脂肪酶不足，促進(jìn)脂肪消化吸收

微生物脂肪酶相比于腸道脂肪酶具有更強(qiáng)的耐受性。Canioni等(1977)通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根霉菌來源的脂肪酶不需要輔脂酶的協(xié)助即可發(fā)揮作用。Kermanshahi等(1998)研究表明，在家禽小腸近端環(huán)境下，輔脂酶對微生物脂肪酶沒有促進(jìn)作用。Raimondo等(1994)研究發(fā)現(xiàn)，相比于豬胰脂肪酶，莢殼假單胞菌來源的脂肪酶不受輔脂酶和膽汁酸的影響，他們認(rèn)為細(xì)菌源的脂肪酶的耐受性比豬胰脂肪酶更強(qiáng)。Namboodiri等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉源脂肪酶在天然條件下能夠不被胰蛋白酶和糜蛋白酶水解（說明微生物脂肪酶耐蛋白酶，可以在腸道發(fā)揮作用）。因此，外源添加微生物脂肪酶能夠到達(dá)小腸發(fā)揮促進(jìn)脂質(zhì)消化的作用，有效地補(bǔ)充內(nèi)源脂肪酶的不足。

Pratuangde等（2000）從不動桿菌LP009中分離的脂肪酶，在50℃、pH值7.0時(shí)活性最高，在45℃以下，pH值4.0～8.0之間，均有穩(wěn)定的活性，該酶能改善大豆粉和預(yù)混合動物飼料中脂肪的消化。秦鵬（2003）試驗(yàn)表明，乳化劑與脂肪酶復(fù)合使用顯著提高了35～49日齡及 21～49日齡肉雞的平均日增重（P＜0.05），改善了飼喂動物性脂肪的肉雞生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益，但是乳化劑與脂肪酶沒有顯著互作。何前等（2009、2010）試驗(yàn)表明，日糧中添加脂肪酶可以顯著提高黃羽肉雞和嶺南黃公雞的生產(chǎn)性能，提高其脂肪表觀消化率，并不同程度地影響了其他營養(yǎng)成分的表觀消化率。

2.2 調(diào)節(jié)CCK分泌，影響胰腺消化酶分泌和采食

CCK作為一種主要的胃腸激素，調(diào)節(jié)胰腺分泌、膽囊收縮和抑制胃部運(yùn)動等，這些功能都與脂肪的消化吸收有著重要關(guān)系。CCK水平除了受到中樞神經(jīng)的調(diào)節(jié)，也受到日糧成分的調(diào)節(jié)（Rodger，2000）。脂肪和蛋白的水解產(chǎn)物能最有效地刺激CCK的分泌，其中甘油三酯水解產(chǎn)物中的脂肪酸，蛋白水解產(chǎn)物中的二肽、三肽或氨基酸能有效地刺激CCK分泌(Brodish等，1994；Rodger，2000)。Tanaka 等（2008）給小鼠胃部和十二指腸灌注辛酸和α-亞麻酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過胃部灌注α-亞麻酸極顯著升高血清中CCK含量，此外試驗(yàn)驗(yàn)證了長鏈脂肪酸誘導(dǎo)CCK分泌是通過GPR120和鈣離子信號作用的。Matzinger等（2000）試驗(yàn)表明，長鏈脂肪酸可以刺激CCK分泌，從而抑制了采食。所以胃腸道對脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生的游離脂肪酸的回應(yīng)是雙方面的，一方面促進(jìn)消化酶分泌，促進(jìn)消化；另一方面又抑制采食。當(dāng)日糧中額外添加外源脂肪酶，脂肪在到達(dá)胃腸之前就有可能被外源脂肪酸部分水解，產(chǎn)生游離脂肪酸，作用于胃部的脂肪酸受體，從而刺激CCK和胰消化酶的分泌，同時(shí)也會不同程度上抑制采食。

2.3 與油脂協(xié)同作用，抑制腸道內(nèi)有害病菌繁殖

在畜禽生產(chǎn)中，由于抗生素的逐步禁用，抗生素類藥物代替品一直是研究的重要內(nèi)容。Dierick等(2002、2003、2004)利用含有中鏈脂肪酸的油脂和脂肪酶的協(xié)同作用，在模擬胃環(huán)境(37℃、pH值3～6、3 h)下的組合水解試驗(yàn)表明，適量添加脂肪酶能部分釋放中鏈脂肪酸。試驗(yàn)表明，這些中鏈脂肪酸能夠調(diào)節(jié)和穩(wěn)定胃腸道微生物群系，對有害微生物的生長具有顯著的抑制作用，起到類似抗生素的作用。由此推測，脂肪和脂肪酶的合理搭配可能起到降低仔豬飼料中抗生素使用量的作用。

2.4 改變脂肪水解產(chǎn)物，影響體內(nèi)脂質(zhì)代謝

雖然微生物脂肪酶在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用具有良好的前景，但是試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，微生物脂肪酶添加到動物飼料中，仍存在一些有待解決的問題，如非特異性脂肪酶水解產(chǎn)物多樣性，其產(chǎn)物的營養(yǎng)效果尚不明確。Lichovnikova等（2002）試驗(yàn)表明，日糧中長期添加脂肪酶增加蛋雞平均蛋重和脂肪沉積，顯著提高肝臟重量（P＜0.05）和極顯著提高雞蛋多不飽和脂肪酸含量（P＜0.01）。而另外一方面，Meng等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，1，3-甘油二脂可以顯著降低大鼠的肥胖程度和抑制其體內(nèi)脂肪的蓄積,起到減肥的效果,并且這種效果呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，而其抑制機(jī)理尚不清楚。其試驗(yàn)所用的1,3-甘油二脂就是通過脂肪酶轉(zhuǎn)脂作用得來的,這有可能會給畜禽生產(chǎn)帶來潛在的負(fù)面效果。而且如果選用非水解特異性脂肪酶，也可能在水解過程中產(chǎn)生1-甘油單酯、3-甘油單酯或甘油，其在腸道內(nèi)吸收機(jī)制和利用效果與2-甘油單酯不同，且吸收速度比 2-甘油單酯慢（Meng等,2004；Iqbal等,2009）。

2.5 影響飼料質(zhì)量

微生物脂肪酶作用位置和作用程度難以控制，容易影響飼料質(zhì)量。添加脂肪酶可能加快飼料中原有脂肪的分解，影響飼料的貯藏穩(wěn)定性。Dierick等(2002)對3種不同油脂的飼料配方分別進(jìn)行添加或不添加脂肪酶的貯藏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在20℃下貯存6個月后，其脂肪分解為每千克總脂肪酸含有250～850 g游離脂肪酸，其中添加了脂肪酶的配合飼料油脂分解明顯高于不添加脂肪酶的配合飼料。Hassan(1998)試驗(yàn)也認(rèn)為，在肉雞和火雞日糧中添加脂肪酶卻不能發(fā)揮促消化和生長的作用，主要可能是每克飼料中添加400 U水平的飼料相對對照組在混合或者貯存過程中，甘油三酯幾乎完全水解成游離脂肪酸和甘油，即游離脂肪酸的存在有可能降低了脂肪的利用率，或者對內(nèi)源胰消化液的分泌有負(fù)反饋?zhàn)饔谩?/p>

而且不同脂肪酶的活性不同，其導(dǎo)致的油脂分解程度也不同。其他相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果表明，脂肪的水解比例還受乳化劑、熱處理時(shí)間和貯藏溫度等因素的影響。脂肪水解可能降低其抗氧化能力，不利于飼料長期存放。

3 展望

目前市面上飼料用脂肪酶并不多，但是用于工業(yè)的脂肪酶生產(chǎn)已經(jīng)比較成熟，具有推廣應(yīng)用于飼料添加劑的前景，但是兩個領(lǐng)域?qū)χ久傅囊蟛⒉煌?，如何篩選適合的脂肪酶作為飼料添加劑尤為重要。組合型酶制劑在完全可控的條件下具有協(xié)同增效的作用，但是在動物飼養(yǎng)環(huán)境中，由于因素太多，其增效作用并不如可控條件下明顯，因此，如何優(yōu)化組合酶制劑也是一個研究的重點(diǎn)。此外，由于脂肪酶的水解特異性，其水解產(chǎn)物對于動物而言并不完全是最適的，為了得到最優(yōu)的生產(chǎn)效果，所以還得通過篩選、優(yōu)化組合、飼養(yǎng)試驗(yàn)，挑選出對動物生產(chǎn)最適的脂肪酶。

[1]Jaeger K-E,Ransac S,Dijkstra B W,et al.Bacterial lipases[J].Fems Microbiology Reviews,1994,15(1):29-63.

[2]Gupta R,Gupta N,Rathi P.Bacterial lipases:an overview of production,purification and biochemical properties[J].applied microbiology and biotechnology,2004,64(6):763-781.

[3]Hasan F,Shah A A,Hameed A.Industrial applications of microbial lipases[J].Enzyme and Microbial Technology,2006,39:235-251.

[4]Sharma R,Chisti Y,Banerjee U C.Production,purification,characterization,and applications of lipases[J].Biotechnology Advances,2001,19:627-662.

[5]Palekar A A,Vasudevan P T,Yan S.Purification of lipase:a review[J].Biocatal Biotransform,2000,18:177-200.

[6]Treichel H,Oliveira D,Marcio A,et al.A Review on Microbial Lipases Production[J].Food Bioprocess Technology,2010,3:182-196.

[7]Nardini M,Dijkstra B W.α/β Hydrolase fold enzymes:the family keeps growing[J].Current Opinion in Structural Biology,1999,9:732-737.

[8]Panzanaro S,Nutricati E,Miceli A,et al.Biochemical characterization of a lipase from olive fruit(Olea europaea L.)[J].Plant Physiology and Biochemistry,2010,48:741-745.

[9]Dharmsthiti S,Pratuangdejkul J,Theeragool G T,et al.Lipase activity and gene cloning of Acinetobacter calcoaceticus LP009[J].Journal of General and Applied Microbiology,1998,44:139-145.

[10]Pratuamgdejkul J,Dharmsthiti S.Purification and characterization of lipase form psychrophilic Acinetobacter calcoaceticus LP009[J].Microbiological Research,2000,155:95-100.

[11]Snellman E A,Sullivan E R,Colwell R R.Purification and properties of the extracellular lipase,LipA,of Acinetobacter sp.RAG-1[J].European Journal of Biochemistry,2002,269:5771-5779.

[12]Snellman E A,Sullivan E R,Colwell R R.Purification and properties of the extracellular lipase,LipA,of Acinetobacter sp.RAG-1[J].European Journal of Biochemistry,2002,269:5771-5779.

[13]Mhetras N C,Bastawde K B,Gokhale D V.Purification and characterization of acidic lipase from Aspergillus niger NCIM 1207[J].Bioresource Technology,2009,100:1486-1490.

[14]Al-Marzooqi W,Leeson S.Evaluation of Dietary Supplements of Lipase,Detergent,and Crude Porcine Pancreas on Fat Utilization by Young Broiler Chicks[J].Poultry Science,1999,78:1561-1566.

[15]Al-Marzooqi W,Leeson S.Effect of Dietary Lipase Enzyme on Gut Morphology,Gastric Motility and Long-Term Performance of Broiler Chicks[J].Poultry Science,2000,79:956-960.

[16]Polin D,Wing T L.The effect of bile aeids and lipase on absorption of tallow by young chicks[J].Poultry Science,1980,59:2738-2743.

[17]Canioni P,Julien R,Rathelot J,et al.Pancreatic and microbial lipases:a comparison of the interaction of pancreatic colipase with lipases of various origins[J].Lipids,1977,12:393-397.

[18]Kermanshahi H,Maenz D D,Classen H L.Stability of porcine and microbial lipases to conditions that approximate the small intestine of young birds[J].Poultry Science,1998,77:1671-1677.

[19]Raimondo M,DiMagno E P.Lipolytic activity of bacterial lipase survives better than that of porcine lipase in human gastric duodenal content[J].Gastroenteroiogy,1994,107(1):231-235.

[20]Namboodiri V M H,Chattopadhyaya R.Purification and Biochemical Characterization of a Novel Thermostable Lipase from Aspergillus niger[J].Lipids,2000,35:495-502.

[21]Pratuangde J,Dharmsthiti S.Purification and characterization of lipase from Psychrophillic Acinetobacter calcoaceticus LP009[J].Microbiology Reviews,2000,155(2):95-100.

[22]秦鵬.脂肪來源、乳化劑和脂肪酶對肉雞生產(chǎn)和脂肪利用的影響[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2003:45-49.

[23]何前,陳莊,容庭,等.脂肪酶對黃羽肉雞生產(chǎn)性能及養(yǎng)分表觀利用率的影響[J].中國飼料,2010(19):17-19.

[24]何前.脂肪酶對嶺南黃公雞生產(chǎn)性能及養(yǎng)分利用的影響[D].廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2009:12-35.

[25]Rodger A L.Regulation of cholecystokinin secretion in humans[J].J.Gastroenterol.,2000,35:181-187.

[26]Brodish R J,Kuvshinoff B W,Fink A S,et al.Intraduodenal acid augments oleic acid(C18)-induced cholecystokinin release[J].Ann NY Acad.Sci.,1994,713:388-390.

[27]Tanaka T,Katsuma S,Adachi T,et al.Free fatty acids induce cholecystokinin secretion through GPR120[J].Naunyn-Schmiedebergs Arch.Pharmacol.,2008,377:523-527.

[28]Matzinger D,Degen L,Drewe J,et al.The role of long chain fatty acids in regulating food intake and cholecystokinin release in humans[J].Gut,2000;46:688-693.

[29]Dierick N A,Decuypere J A.The combined use of triacylglycerols containing medium-chain fatty acids and exogenous lipolytic enzymes as an alternative to in-feed antibiotics in piglets:concept,possibilities and limitations.An overview[J].Nutrition Research Reviews,2003,16:193-209.

[30]Dierick N A,Decuypere J A,Degeyter I.The combined use of whole Cuphea seeds containing medium chain fatty acids and an exogenous lipase in piglet nutrition[J].Archives of Animal Nutrition,2004,57(1):49-63.

[31]Dierick N A,Decuypere J A,Molly K,et al.The combined use of triacylglycerols(TAGs)containing medium chain fatty acids(MCFAs)and exogenous lipolytic enzymes as an alternative to nutritional antibiotics in piglet nutrition[J].Livestock Production Science,2002,75(2):129-142.

[32]Lichovnikova M,Zeman L,Klecker D,et al.The effects of the long-term feeding of dietary lipase on the performance of laying hens[J].Czech J.Anim.Sci.,47,2002(4):141-145.

[33]Meng X H,Zou D Y,Shi Z P,et al.Dietary Diacylglycerol Prevents High-Fat Diet-Induced Lipid Accumulation in Rat Liver and Abdominal Adipose Tissue[J].Lipids,2004,39:37-41.

[34]Iqbal J,Hussain M M.Intestinal lipid absorption[J].American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism,2009,296:1183-1194.

[35]Murase T,Mizuno T,Omachi T,et al.Dietary diacylglycerol suppresses high fat and high sucrose diet-induced body fat accumulation in C57BL/6J mice[J].Journal of Lipid Research,2001,42:372-378.

[36]Taguchi H,Nagao T,Watanabe H,et al.Energy value and digestibility of dietary oil containingmainly 1,3-diacylglycerol are similar to those of triacylglycerol[J].Lipids,2001,36:379-382.

[37]Dierick N A,Decuypere J A.Endogenous lipolysis in feedstuffs and compound feeds for pigs:effects of storage time and conditions and lipase and/or emulsifier addition[J].Animal Feed Science and Technology,2002,102:53-70.

[38]Hassan K.The potential of dietary lipases to improve fat[D].University of Saskatchewan,1998.

[39]王恬,蔣正宇,周巖民,等.飼料外源酶與動物內(nèi)源消化酶的互作效應(yīng)及機(jī)制研究[J].飼料與畜牧,2006(12):50-54.

[40]張鐵鷹,汪儆,李永清.0～49日齡肉仔雞消化參數(shù)的變化規(guī)律研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2005,32(1):6-10.

[41]顏士祿,張鐵鷹,劉強(qiáng),等.愛拔益加肉雞和北京油雞脂肪酶活性及粗脂肪消化率的比較研究[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào).2009,21(3):393-397.