自制AFP/CEA雙標(biāo)記TRFIA試劑臨床應(yīng)用效果觀察

楊鳳愛(ài)，吳修宇，利定建，姚錦繡，梁 健

(陽(yáng)江市人民醫(yī)院，廣東陽(yáng)江529500)

血清甲胎蛋白(AFP)與癌胚抗原(CEA)是腫瘤普查中兩個(gè)最常用的指標(biāo)，在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)及療效評(píng)價(jià)等方面，有著重要的臨床價(jià)值［1～3］。目前臨床上采用的檢測(cè)血清AFP和CEA的方法主要是化學(xué)發(fā)光法，所用試劑均為進(jìn)口，價(jià)格昂貴。2010年 3～5月，我們采用稀土離子銪(Eu3+)和釤(Sm3+)為標(biāo)記物，成功研制了AFP/ CEA雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)試劑，現(xiàn)用其檢測(cè)410份血清標(biāo)本的AFP和CEA，并將其結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法、進(jìn)口試劑檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 自制AFP/CEA雙標(biāo)記TRFIA試劑，以下簡(jiǎn)稱(chēng)AFP/CEA-TRFIA;AFP-CLIA試劑盒(SIEMENS公司);CEA-CLIA試劑盒(SIEMENS公司); AutoDELFIATMhAFP試劑盒(WALLAC公司);AutoDELFIATMhCEA試劑盒(WALLAC公司)。

1.1.2 質(zhì)控品 國(guó)家AFP質(zhì)控品(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，期望濃度分別為25、65和150 U/mL);國(guó)家CEA質(zhì)控品(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，期望濃度分別為25、50和100 ng/mL)。

1.1.3 血清標(biāo)本 由本院檢驗(yàn)科提供，來(lái)自410例患者，共410份。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Auto-DELFIA 1235時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀(Perkin Elmer公司)。

1.2 AFP、CEA檢測(cè)方法 用AFP/CEA-TRFIA試劑和RRFIA法、化學(xué)發(fā)光法和AFP/CEA-CLIA試劑盒重復(fù)檢測(cè)410份血清標(biāo)本。每塊反應(yīng)板用對(duì)應(yīng)的AFP及CEA國(guó)家質(zhì)控品Q(chēng)CⅠ、QCⅡ和QCⅢ進(jìn)行質(zhì)量控制(各設(shè)2復(fù)孔)。對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果有差異的血清再次用自制 AFP/CEA-TRFIA試劑、AFP/CEA-CLIA試劑和WALLAC公司的相應(yīng)單標(biāo)記試劑作復(fù)核試驗(yàn)(3復(fù)孔)。自制試劑檢測(cè)采用一步法進(jìn)行(具體操作參照自制試劑的研制時(shí)設(shè)計(jì)的操作步驟)，其他兩種試劑均嚴(yán)格按其試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷方法

1.3.1 質(zhì)控考核標(biāo)準(zhǔn) ①各質(zhì)控物的平均值在允許范圍內(nèi);②重復(fù)樣本的測(cè)定結(jié)果相差在10%以?xún)?nèi)。不能同時(shí)滿(mǎn)足以上兩個(gè)條件的反應(yīng)板結(jié)果即視為無(wú)效，需重新進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 參考范圍 AFP-CLIA檢測(cè)結(jié)果正常范圍為0～8.1 ng/mL，CEA-CLIA為 0～5 ng/mL;Auto DELFIATMhAFP為0～8.7 U/mL(1 U/mL=1.21 ng/mL)，AutoDELFIATMhCEA為0～5 ng/mL。AFP/ CEA-TRFIA試劑參考范圍 AFP為0～12 U/mL，CEA為0～6.5 ng/mL。超出正常范圍為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算靈敏度和特異度，同時(shí)繪制ROC曲線。

2 結(jié)果

2.1 可靠性考核結(jié)果 對(duì)所收集的410份血清標(biāo)本用自制試劑進(jìn)行測(cè)定，共用9塊反應(yīng)板，每塊板均用AFP(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ)及CEA(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ)質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制(各設(shè)雙復(fù)孔)結(jié)果顯示各濃度質(zhì)控物的測(cè)定平均值在允許范圍內(nèi)且重復(fù)樣本的測(cè)定結(jié)果相差在10%以?xún)?nèi)，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 ROC曲線及曲線下面積 用自制試劑檢測(cè)結(jié)果繪制ROC曲線，結(jié)果AFP、CEA兩指標(biāo)ROC曲線下面積(A z與B z)分別為0.978和0.976，說(shuō)明本試劑的檢測(cè)性能優(yōu)秀。

2.3 靈敏度和特異度 以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，自制試劑檢測(cè)AFP敏感性、特異性均為97.56%;檢測(cè) CEA敏感性 96.05%，特異性98.06%。

2.4 差異血清分析 410份血清中有10份血清AFP陰陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果兩種方法不相同，其中假陽(yáng)性3個(gè)，假陰性7個(gè);有11份血清CEA陰陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果兩種方法不相同，其中假陽(yáng)性6個(gè)，假陰性5個(gè)。再次用自制試劑、化學(xué)發(fā)光試劑、AutoDELFIATMhAFP試劑盒和AutoDELFIATMhCEA試劑盒對(duì)這些差異血清進(jìn)行重復(fù)和復(fù)核試驗(yàn)。結(jié)果10份AFP差異血清用自制試劑復(fù)查前后AFP檢測(cè)結(jié)果完全相同，重復(fù)試驗(yàn)符合率達(dá)100%。有7份差異血清的AFP檢測(cè)結(jié)果與AFP-CLIA、AutoDELFIATMhAFP試劑盒的測(cè)值相同;有2份差異血清(268、369號(hào))與AutoDELFIATMhAFP試劑盒的測(cè)值相同，與 AFPCLIA試劑盒的測(cè)值不相同;有1份差異血清與AutoDELFIATMhAFP、AFP-CLIA試劑盒的測(cè)值不相同。11份CEA差異血清用自制試劑復(fù)查前后CEA檢測(cè)結(jié)果完全相同，重復(fù)試驗(yàn)符合率達(dá)100%。有6份差異血清的測(cè)值與 CEA-CLIA、AutoDELFIATMhCEA試劑盒的測(cè)值相同;有2份差異血清與AutoDELFIATMhCEA試劑盒的測(cè)值相同，與CEA-CLIA試劑盒的測(cè)值不相同;有2份差異血清與 AutoDELFIATMhCEA、CEA-CLIA試劑盒測(cè)值不相同。

3 討論

由于環(huán)境污染、食物因素、生活方式以及工作壓力等因素的影響，目前世界上腫瘤的患患者數(shù)呈上升的態(tài)勢(shì)。肝癌是我國(guó)比較多見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病死率在男性中居惡性腫瘤的第3位，在女性中居第4位，每年死于肝癌的人數(shù)大約在10萬(wàn)以上［4］。肝癌早期手術(shù)切除治療效果較好，但晚期由于癌細(xì)胞擴(kuò)散到全身，其手術(shù)切除治愈效果差。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。血清學(xué)檢測(cè)是肝癌早發(fā)現(xiàn)早診斷的重要手段之一，AFP是大家公認(rèn)的診斷原發(fā)性肝癌的最為特異的指標(biāo)。另外，在新生兒先天愚型和神經(jīng)管畸形診斷方面，AFP也是一個(gè)公認(rèn)的重要指標(biāo)。CEA對(duì)由內(nèi)胚層分化來(lái)的腫瘤，特別是消化道腺癌具有較高的陽(yáng)性檢出率，是結(jié)腸癌、胃癌等的重要檢測(cè)指標(biāo)。近年來(lái)大量的研究報(bào)道證實(shí)多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)檢對(duì)于腫瘤的診斷極為重要，其中AFP與CEA聯(lián)合檢測(cè)有助于判別原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌，而且對(duì)于良惡性肝病具有重要的診斷價(jià)值［5～7］。

目前對(duì)AFP和CEA兩種指標(biāo)檢測(cè)的方法主要包括酶免法、放免法、化學(xué)發(fā)光法和TRFIA法。其中酶免法只能定性或半定量，放免法具有放射性污染，化學(xué)發(fā)光法一次檢測(cè)只能測(cè)定一個(gè)指標(biāo)，而TRFIA是超微量檢測(cè)領(lǐng)域中一項(xiàng)新的檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、標(biāo)記物可穩(wěn)定一年以上且無(wú)放射性污染、操作方便、能進(jìn)行多標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。本文研究的直接采用DTTA-Eu3+和 DTTA-Sm3+作為示蹤物建立的AFP/CEA-TRFIA方法操作簡(jiǎn)單(一步法)、反應(yīng)時(shí)間短(2 h)、線性范圍寬、特異性和精密度好，且與進(jìn)口Perkin Elmer公司同類(lèi)單標(biāo)記試劑在樣本測(cè)定方面具有較好的相關(guān)性，一次檢測(cè)能得到兩種指標(biāo)，符合人們向往已久的靈敏度高、無(wú)放射性污染、高效快捷等要求，因此在臨床檢測(cè)中具有極大的優(yōu)勢(shì)。

一種新的能夠得到推廣的試劑盒必須具備與之相匹配的靈敏度、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、精密性、特異性和可靠性，這是評(píng)價(jià)試劑盒好壞的金標(biāo)準(zhǔn)［8］。另外，通過(guò)對(duì)大量臨床標(biāo)本的檢測(cè)，并將結(jié)果與同類(lèi)產(chǎn)品或方法進(jìn)行比較、統(tǒng)計(jì)和分析來(lái)綜合考核與評(píng)價(jià)，也是考核體外診斷試劑臨床實(shí)際性能的重要內(nèi)容，是綜合評(píng)價(jià)新研發(fā)產(chǎn)品敏感性和特異性的重要試驗(yàn)資料。本研究參考同類(lèi)單標(biāo)記試劑的實(shí)驗(yàn)研究方法［9，10］，用自制試劑對(duì)410份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算敏感性和特異度，結(jié)果其診斷AFP與CEA陽(yáng)性的敏感性分別為97.56%和 96.05%，特異性分別為 97.56%和98.06%，總符合率分別為97.56%和97.32%。兩種方法的測(cè)定值相關(guān)性良好。對(duì)差異血清的進(jìn)一步檢測(cè)，顯示自制試劑的重復(fù)試驗(yàn)符合率達(dá)100%，表明自制試劑穩(wěn)定性好。自制試劑操作簡(jiǎn)單(一步法)，費(fèi)時(shí)短(2 h)，所需血清量少(25 μL)，在檢測(cè)性能上與目前臨床上廣泛應(yīng)用的化學(xué)發(fā)光法相仿，能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需要。另外，自制試劑一次檢測(cè)可同時(shí)獲得血清中AFP和CEA兩種指標(biāo)，這點(diǎn)對(duì)于一些珍貴的標(biāo)本及在腫瘤的大規(guī)模普查上尤顯優(yōu)勢(shì)，有推廣應(yīng)用的價(jià)值。

對(duì)于出現(xiàn)差異的原因，初步考慮為以下兩個(gè)因素:①不同公司的試劑、不同檢測(cè)方法所選用的抗原和緩沖體系可能不一樣，導(dǎo)致所測(cè)結(jié)果有差異;②部分差異標(biāo)本的測(cè)值在正常參考值范圍的上限附近，這種稱(chēng)為灰區(qū)的測(cè)值有可能影響結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)一步作臨床追蹤檢測(cè)才可能進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的判斷和臨床意義的分析。

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