地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

陳永秀綜述，蒙開喜審校

(廣西橫縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 橫縣 530300)

地中海貧血(thalassemias) 是一類以珠蛋白α鏈或β 鏈合成不足或缺失為特征的隱性遺傳性疾病。最常見為α-地中海貧血(α-地貧)和β-地中海貧血(β-地貧)，在我國主要分布在南方，如廣東、廣西、海南、香港有著較高的發(fā)病率[1]。開展地貧檢測是臨床上診斷貧血類型必不可少的項(xiàng)目，進(jìn)行血紅蛋白電泳及基因檢測可以診斷是否是地貧及地貧的類型。區(qū)分貧血類型有利對臨床貧血的治療，避免過分補(bǔ)充鐵劑造成地貧患者的損害。產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷可避免重型地貧患兒的出生[2]，對優(yōu)生具有重要意義。目前檢測地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室方法主要有篩查法和基因診斷法兩種。

1 檢測地中海貧血方法(篩查法)

1.1 血常規(guī)測定 地中海貧血的重要典型特征之一是小細(xì)胞，低色素，最重要的血液學(xué)指標(biāo)為MCV<80fl,MCH<27pg，則可能為地中海貧血(或其基因攜帶者)或缺鐵性貧血。利用MCV、MCH 作為地中海貧血的一種初篩手段具有重要的實(shí)用價(jià)值[3]。

1.2 紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 涂片、瑞氏染色，由于貧血輕重不一，紅細(xì)胞可出現(xiàn)大小不均、多種異常形態(tài)、嗜堿性點(diǎn)彩紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞等。貧血越嚴(yán)重，異形性越明顯。

1.3 紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)(一管法) 地中海貧血的紅細(xì)胞膜存在形態(tài)、生化、代謝異常，故地中海貧血患者的紅細(xì)胞脆性降低[4]，在0.36%NaCl 中溶解度降低(脆性降低)。缺鐵性貧血亦呈陽性。近幾年來國內(nèi)外普遍采用MCV和紅細(xì)胞透脆性試驗(yàn)作為地貧診斷的篩查檢測項(xiàng)目[5]。

1.4 不穩(wěn)定血紅蛋白測定

1.4.1 異丙醇試驗(yàn) 地中海貧血血液中存在不穩(wěn)定血紅蛋白，不穩(wěn)定血紅蛋白在370C的17%異丙醇溶液中在5min 出現(xiàn)沉淀，20min 左右形成絮狀。

1.4.2 熱變性試驗(yàn) 不穩(wěn)定血紅蛋白在加溫時(shí)比正常血紅蛋白更容易發(fā)生沉淀。在500C～600C 時(shí)α-地中海貧血的沉淀量偏高。此法敏感性不高，容易受比色影響，而特異性比異丙醇試驗(yàn)高。

1.4.3 變性血紅蛋白包涵體檢查 將含有不穩(wěn)定血紅蛋白的紅細(xì)胞在體外與煌焦油藍(lán)等試劑370C 孵育1h 及2h 后便生成大量包涵體。α-地中海貧血HbH 病的紅細(xì)胞內(nèi)含有較多包涵體，變性血紅蛋白包涵體是診斷HbH 病的一項(xiàng)簡易、方便的方法，同時(shí)對α-地中海貧血1和α-地中海貧血2的診斷也有重要意義。

1.5 血紅蛋白電泳 血紅蛋白電泳是檢測和識(shí)別異常血紅蛋白最常用的實(shí)驗(yàn)室方法[6]。

1.5.1 血紅蛋白醋酸纖維薄膜電泳 各種血紅蛋白均帶有電荷，其等電點(diǎn)均在7 以下，故在pH8.5的緩沖液中各種血紅蛋白均帶負(fù)電荷，在電場的作用下都向陽極泳動(dòng)，不同的血紅蛋白，其等電點(diǎn)不同，電泳速度不一，故在電泳圖譜上呈現(xiàn)不同位置區(qū)帶。還可以比較各區(qū)帶染色強(qiáng)度，換算出HbF、HbA2等的含量，對血紅蛋白病的篩查有重要價(jià)值。但是，有些異常血紅蛋白總的電荷改變極少或不改變，特別是某些不穩(wěn)定的血紅蛋白及氧親和力增強(qiáng)的異常血紅蛋白，電泳時(shí)它們不能和HbA 分離而不被檢出。因而進(jìn)一步用多種不同的電泳和用不同的支持介質(zhì)、緩沖劑、電泳儀器及各種方法。醋酸纖維薄膜較脆，容易破碎，區(qū)帶顏色容易脫，不易保存。應(yīng)用大樣醋酸纖維薄膜電泳可將各種血紅蛋白區(qū)帶成分分離，洗脫測定各組分的含量。進(jìn)行區(qū)帶鑒別與含量的測定，對地中海貧血的診斷起到關(guān)鍵的作用。常用醋酸纖維薄膜pH8.5的緩沖液中進(jìn)行不連續(xù)電泳，將HbA2分離、然后分別剪取HbA2、HbA 區(qū)帶，用蒸餾水浸泡，用比色計(jì)比色，計(jì)算出HbA2含量。測定HbA2含量對于地貧的診斷有重要意義[7]。有HbH、Hb Bart’s 區(qū)帶時(shí)剪取HbH、Hb Bart’s 區(qū)帶，測定HbH、Hb Bart’s含量。

1.5.2 珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳 用尿素將血紅蛋白解離成多肽鏈，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的電荷與分子篩效應(yīng)，將各種肽鏈分離，形成不同的區(qū)帶，當(dāng)各種珠蛋白鏈的合量或結(jié)構(gòu)發(fā)生異常時(shí)，珠蛋白鏈區(qū)帶出現(xiàn)與正常不同的改變，通過各區(qū)帶含量比例的測定了解各珠蛋白基因的表達(dá)，可檢出β0-β+地中海貧血和大部分α-地中海貧血患者。缺點(diǎn)是操作煩瑣，試劑毒性大，結(jié)果不穩(wěn)定，容易引起ζ 珠蛋白鏈假陽性。

1.5.3 高效液相色譜(HPLC) 現(xiàn)已用于定量分析HbA2和HbF。研究表明，采用(HPLC)技術(shù)的陰陽離子交換層析儀進(jìn)行血紅蛋白自動(dòng)化分析及抗堿血紅蛋白測定等相比，具有快速簡便、結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)。尤其對β-珠蛋白生成障礙性貧血有良好的快速診斷能力[8]。

1.5.4 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CE)全自動(dòng)毛細(xì)管區(qū)帶電泳法是充滿緩沖液的石英管中進(jìn)行電泳技術(shù)。在溶血試劑中進(jìn)行稀釋的紅細(xì)胞樣品會(huì)被注射到毛細(xì)管的陽極端，在高電壓的作用下進(jìn)行分離，在陰極端415nm 波長下直接檢測血紅蛋白各組分含量。對HbA2可自動(dòng)鑒別和定量該區(qū)帶，可完美區(qū)分和聚焦HbA與HbS 之間的HbF，并可對其進(jìn)行精確測定[9]。

1.5.5 全自動(dòng)瓊脂糖電泳全自動(dòng)瓊脂糖電泳是根據(jù)不同Hb 分子所帶電荷不同，在電場中遷移率不同而達(dá)到分離Hb 不同成份的目的。經(jīng)染色、脫色、固定，烘干后用掃描儀掃描電泳膠片，對各條區(qū)帶進(jìn)定量分析?？蓲呙璧贸鯤bA2、HbA、HbF、HbH、Hb Bart’s 及其他異常血紅蛋白含量。其方法簡便，電泳和染色可同時(shí)進(jìn)行，所用時(shí)間短，掃描得出較準(zhǔn)確的各組分的血紅蛋白含量。電泳瓊脂糖膠片容易保存，區(qū)帶顏色不容易脫，區(qū)帶清淅，根據(jù)HbA2、、HbA、HbF的含量能將地中海貧血初步分為α-地中海貧血和β-地中海貧血，是目前篩查地中海貧血較理想的方法。全自動(dòng)瓊脂糖電泳系統(tǒng)能準(zhǔn)確分離各種區(qū)帶，圖譜可永久保存[10]。缺點(diǎn)是不能進(jìn)行分型，且得出的HbH、Hb Bart’s 區(qū)帶有些呈散在的云霧狀，容易引起假陰性。因而有研究建議檢測時(shí)應(yīng)注意[11]，當(dāng)HbA2區(qū)帶淡染含量降低，異丙醇試驗(yàn)陽性時(shí)最好做醋酸纖維薄膜電泳報(bào)告。

2 基因診斷

基因診斷又稱分子診斷，是通過對受檢者某一特定基因(DNA)或某轉(zhuǎn)錄物(mRNA)進(jìn)行分析來對遺傳病進(jìn)行診斷的技術(shù)。我國對地中海貧血的基因診斷多年來先后經(jīng)歷了DNA 點(diǎn)雜交、限制性內(nèi)切酶酶譜分析，限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)鏈鎖分析、寡核苷酸(ASO)探針雜交和了聚合鏈酶反應(yīng)(PCR)體外基因擴(kuò)增、芯片技術(shù)等6個(gè)發(fā)展階段。特別是PCR 及其相關(guān)發(fā)展技術(shù)，已成為最為普遍的診斷方法。

2.1 限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)鏈鎖分析原理 DNA 限制性內(nèi)切酶可識(shí)別并切割DNA 上特定核苷酸序列，得到一定長度的DNA 片段，而堿基的突變可導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的丟失或形成，從而改變酶切片段的大小。突變基因在經(jīng)過相應(yīng)限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量與大小都會(huì)發(fā)生改變，根據(jù)這些改變可判斷突變是否存在。缺點(diǎn)是不能直接測出受檢者突變基因的類型，且操作繁瑣。

2.2 探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)(ASO) 應(yīng)用引物擴(kuò)增珠蛋白基因，同時(shí)合成與正常序列和突變序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸探針。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)在尼龍膜上，分別與標(biāo)記的正常和突變的ASO 探針雜交，不完全互補(bǔ)的探針在一定條件下可完全洗脫，再從放射自顯影觀察雜交結(jié)果。這種檢測方法快速、靈敏，缺點(diǎn)是對DNA的純度和數(shù)量要求較高。目前已廣泛應(yīng)用于β-地中海貧血的基因診斷。

2.3 聚合鏈酶反應(yīng)(PCR) PCR 是利用DNA 聚合酶等在體外的條件下 催化一對引物間的特異DNA 片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)。以PCR為基礎(chǔ)的診斷方法已應(yīng)用于α-地中海貧血的基因診斷[12]。特別是多重PCR，它的特點(diǎn)是在一個(gè)PCR 體系內(nèi)包含4 對等位基因的特異引物。根據(jù)每個(gè)突變位點(diǎn)特異擴(kuò)增來判斷結(jié)果。應(yīng)用多重PCR 法可檢測α-珠蛋白基因東南亞缺失(-SEA)、右缺失(-α3.7)和左缺失(-α4.2)。多重PCR可對缺失型α-地中海貧血進(jìn)行基因分型和類別辨別[13]。利用單管多重PCR可準(zhǔn)確、快速檢測出(-SEA、-α3.7、-α4.2)用于α-地中海貧血分子篩查和產(chǎn)前診斷[14]。

2.4 Southern 印跡雜交 鑒別DNA 靶分子的雜交稱為Southern 印跡雜交，是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA 片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上然后用標(biāo)記的DNA 探針檢測待測DNA的一種方法。利用Southern 印跡雜交可以檢測基因缺失。到目前為止，Southern 印跡雜交技術(shù)診斷α-地中海貧血仍然是基因診斷α-地中海貧血的金標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 缺口PCR 其原理是設(shè)計(jì)三對或兩對引物 即在缺失區(qū)域外側(cè)，靠近缺失位點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)一對引物，另外一個(gè)或一對引物在缺失區(qū)域內(nèi)。在缺失區(qū)域內(nèi)的引物能夠在雜合子與正常人中擴(kuò)增出片段，在缺失純合子中不能擴(kuò)增，在缺失區(qū)域外側(cè)的一對引物，因?yàn)槿笔瓜嗑嗌踹h(yuǎn)的兩端DNA 拉近，從而可擴(kuò)增出特定的DNA 片段，從而檢出純合子患者。有文獻(xiàn)報(bào)道用缺口PCR 法成功檢測出三種缺失型地中海貧血[15]。

2.6 反向點(diǎn)雜交法 其原理與傳統(tǒng)的等位基因特異性寡核苷酸探針點(diǎn)雜交的原理基本相同，所不同的是：將膜上固定探針取代固定靶DNA，經(jīng)一次雜交可對未知樣品中多個(gè)突變進(jìn)行檢測，改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測一種突變的方式。具有快速、敏感、操作簡單的特點(diǎn)。是目前國內(nèi)外最常用的技術(shù)，呂燕波[16]報(bào)道，應(yīng)用此法可以同時(shí)檢測β-珠蛋白基因是否發(fā)生17個(gè)點(diǎn)的突變。而且這種方法還可以區(qū)分突變類型的純合子、雜合子、雙重雜合子及正常基因。適用于中國人群常用見突變類型β-地貧基因檢測。反向點(diǎn)雜交技術(shù)也應(yīng)用于診斷非缺失型α-地中海貧血的點(diǎn)突變[17]。

2.7 熒光PCR比普通的PCR 敏感性高出1000倍以上，用不同顏色的熒光素對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，在DNA 測序儀上同時(shí)檢測出不同顏色、不同片段的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，從而分辨正常人、雜合子和純合子。應(yīng)用熒光PCR的基因掃描方法，可檢測廣西地區(qū)最常見的幾種β 珠蛋白基因突變，本法簡單，快速，靈敏度高，樣本DNA 用量少[18]。

2.8 基因芯片 根據(jù)基因芯片上不同位置所出現(xiàn)的熒光位點(diǎn)顏色及強(qiáng)弱的變化來判斷地中海貧血的基因突變類型，與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片的診斷技術(shù)在核酸擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，采用熒光標(biāo)記引物延伸的方法，可提高檢測結(jié)果的敏感性和特異性，由于基因芯片高通量特點(diǎn)，可將α、β 地中海貧血基因診斷在一張芯片上完成。適用于大面積的普查。地貧診斷基因芯片具有簡便、省時(shí)等特點(diǎn)[19]。

3 小結(jié)

隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測的技術(shù)也隨之提高，篩查與基因診斷的的技術(shù)也越來越成熟?；鶎俞t(yī)院由于條件關(guān)系，開展基因檢測比較困難，因此有必要應(yīng)用多種篩查方法相結(jié)合，以提高地中海貧血診斷的準(zhǔn)確性，為地貧基因檢測分型提供依據(jù)?；蚍治鍪亲羁煽康脑\斷在中海貧血的方法，但目前基因分析費(fèi)用昂貴、操作繁鎖、費(fèi)時(shí)、對操作人員要求較高，限制了這方面的普及，因此費(fèi)用低廉、結(jié)果可靠、使用方便、安全省時(shí)的基因診斷技術(shù)是人們盼望的事情。地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)還須精益求精，更能準(zhǔn)確診斷地中海貧血貧血，減少漏診和誤診，盡力創(chuàng)造出最為適合患者診斷的實(shí)驗(yàn)手段。

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