大腸桿菌工程菌利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的研究

李坤朋，許雅潔，趙錦芳，王金華*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

乳酸是一種天然存在的有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中[1-2]。乳酸分子中含有一個(gè)手性的碳原子，具有旋光性，從而具有L-型和D-型2種構(gòu)型。當(dāng)L-型和D-型乳酸等比例混合時(shí)，即為消旋的DL-乳酸。作為三大有機(jī)酸之一，乳酸、乳酸鹽及其乳酸衍生物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、釀造、紡織、化工和印染工業(yè)[3-5]。由于人體只含有L-乳酸脫氫酶，D-乳酸無(wú)法被人體代謝，在食品添加劑和內(nèi)服藥物方面D-乳酸應(yīng)用受到限制。L-乳酸最具前景的應(yīng)用在于聚乳酸（PLA）。PLA是一種可降解的，具有良好使用性能的生物相容性高分子材料，用于制造可生物降解塑料，近些年一直成為關(guān)注和研究的熱點(diǎn)[6]。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)和石油危機(jī)的加劇，生物塑料勢(shì)必被大量應(yīng)用進(jìn)而取代傳統(tǒng)塑料。全球最大的生物塑料生產(chǎn)商是NatureWorks公司，其年生產(chǎn)能力達(dá)14萬(wàn)t。全球生物塑料年產(chǎn)能2020年將達(dá)80萬(wàn)t～95萬(wàn)t，這就表明聚乳酸無(wú)疑是今后值得期待的一種聚合物。L-乳酸作為PLA的生產(chǎn)原料，需求量巨大，前景非常廣闊。

目前90%以上的L-乳酸是通過(guò)微生物發(fā)酵法獲得[7]，主要以農(nóng)副產(chǎn)品為原料，通過(guò)特定的微生物發(fā)酵生產(chǎn)制得光學(xué)純度很高的L-乳酸。國(guó)內(nèi)外用于工業(yè)化生產(chǎn)L-乳酸的特定微生物主要有：乳桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）和根霉菌（Rhizopus）等工業(yè)微生物種屬[8]。大腸桿菌作為L(zhǎng)-乳酸的生產(chǎn)菌種在國(guó)內(nèi)少有文獻(xiàn)報(bào)道，在國(guó)外ZHOU S等[9]將乳酸片球菌Pediococcus acidilactici的ldhL基因替換掉大腸桿菌中的ldhA基因，從而得到了糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)95%的高光學(xué)純度L-乳酸工程菌SZ85。利用大腸桿菌產(chǎn)L-乳酸，相比其他微生物具有遺傳背景清楚、易于進(jìn)行分子生物學(xué)操作、繁殖快、發(fā)酵周期短、營(yíng)養(yǎng)要求粗放等優(yōu)勢(shì)[10]。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用染色體插入技術(shù)引入外源基因，構(gòu)建了一株具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的L-型乳酸工程菌株Escherichia coliHBUT-L，其是以HBUT-D[11]為出發(fā)菌株，通過(guò)敲除其D-乳酸脫氫酶基因同時(shí)插入L-乳酸脫氫酶基因所得到的。HBUT-L能在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中高效利用葡萄糖進(jìn)行L-型乳酸發(fā)酵，L-乳酸光學(xué)純度達(dá)99%以上，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)97%以上。雖然利用無(wú)機(jī)鹽為營(yíng)養(yǎng)可替代成本高的有機(jī)培養(yǎng)基（如蛋白胨、酵母浸膏等），但仍需研究利用來(lái)源豐富、廉價(jià)的發(fā)酵底物為HBUT-L工業(yè)化生產(chǎn)L-乳酸打下基礎(chǔ)。作為一種廉價(jià)的，常常被用作細(xì)菌發(fā)酵的有機(jī)氮源，玉米漿是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得的，含有可溶性蛋白、生物素、無(wú)機(jī)鹽和糖等，營(yíng)養(yǎng)豐富[12]。本文研究了HBUT-L在以玉米漿為有機(jī)氮源，葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳源的玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，嘗試用玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基取代無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，降低L-乳酸的發(fā)酵成本，為其工業(yè)化生產(chǎn)提高參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Escherichia coliHBUT-L由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建和保藏，該菌株以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的高產(chǎn)D-乳酸工程菌HBUT-D[11]為出發(fā)菌株，敲除其D-乳酸脫氫酶基因，同時(shí)插入帶有自身啟動(dòng)子序列的L-乳酸脫氫酶基因，具有良好的L-乳酸發(fā)酵特性。

1.1.2 原料和培養(yǎng)基

玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液由山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司提供。無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：10%葡萄糖的NBS培養(yǎng)基[6]。玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液混合液，使培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量在20g/L左右，葡萄糖含量在10%左右，另外加0.1%（NH4）2HPO4和1mmol/L甜菜堿。葡萄糖滅菌條件為115℃滅菌30min，其他滅菌條件為121℃滅菌20min。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

HBUT-L在平板培養(yǎng)基中于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h～48h，接種于裝有200mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于搖床中37℃、200r/min培養(yǎng)16h。

1.2.2 發(fā)酵方式

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在7L的貝朗發(fā)酵罐中進(jìn)行，裝液量4L，接種量5%，37℃、200r/min培養(yǎng)，用6mol/L KOH作中和劑，自動(dòng)調(diào)節(jié)pH值為7左右，發(fā)酵至停止加堿時(shí)結(jié)束。

1.2.3 分析方法

菌體濃度：比濁法（A600），分光光度計(jì)測(cè)量。所取發(fā)酵液樣品在10000r/min條件下離心10min，去除細(xì)胞殘留，收集上清液用于測(cè)定葡萄糖及乳酸含量。葡萄糖和乳酸濃度采用HPLC測(cè)定，檢測(cè)條件為Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀；色譜柱：Bio-Rad HPX 87H；流動(dòng)相：4mmol/L H2SO4；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL；流速：0.5mL/min。乳酸光學(xué)純度采用HPLC測(cè)定，檢測(cè)條件為：色譜柱：NUCLEOSIL 120-5 Chiral-L；流動(dòng)相：0.2mmol/L H2SO4；紫外檢測(cè)器240nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.5mL/min。

1.2.4 計(jì)算方法

乳酸和葡萄糖濃度以發(fā)酵初始體積（4L）計(jì)算，其濃度由測(cè)量值乘以發(fā)酵體積（初始體積與加堿體積之和，取樣體積忽略不計(jì)）再除以發(fā)酵初始體積計(jì)算得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 HBUT-L利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸

HBUT-L在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基上，以10%的葡萄糖為碳源，發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵培養(yǎng)基中加1mmol/L甜菜堿增加菌體滲透壓耐受性[13]。從圖1和圖2可以看出，（1）HBUT-L在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基上能夠快速生長(zhǎng)，在4h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20h左右到達(dá)穩(wěn)定期，OD最大達(dá)到4.8，34h左右進(jìn)入衰亡期；（2）菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期后產(chǎn)乳酸產(chǎn)量增加，大概10h以后產(chǎn)酸速度明顯加快，此時(shí)的糖耗急速上升，到34h時(shí)糖基本上被消耗完，之后乳酸產(chǎn)量只有小幅增長(zhǎng)，34h后加堿量變化很小，36h已停止加堿，發(fā)酵結(jié)束。

圖1 HBUT-L利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.1 Fermentation process curve of HBUT-L using glucose to produce L-lactic acid

圖2 HBUT-L利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸加堿曲線和pH值Fig.2 Alkali curve and pH value profile during fermentation using glucose to produce L-lactic acid by HBUT-L

HBUT-L構(gòu)建的目的是使其在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基上能高效快速利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸。在4L發(fā)酵當(dāng)中，HBUT-L利用10%的葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸，發(fā)酵至36h時(shí)乳酸產(chǎn)量可達(dá)到97.7g/L，殘?zhí)菨舛葍H為0.14g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率在97%以上，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程乳酸生產(chǎn)率為2.71g/（L·h），利用手性柱實(shí)驗(yàn)測(cè)得L-乳酸的光學(xué)純度在99%以上。

2.2 HBUT-L利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸

為降低發(fā)酵成本，以玉米漿為有機(jī)氮源，葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳源作為玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)取代無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)中所用玉米漿成分比較復(fù)雜，主要含多種氨基酸、無(wú)機(jī)鹽和維生素，成本低，營(yíng)養(yǎng)成分適合細(xì)菌生長(zhǎng)，另外還有少量的乳酸和糖類(lèi)物質(zhì)。通過(guò)計(jì)算，取一定量的玉米漿和廢糖水混合，使玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量在20g/L左右，葡萄糖含量在10%左右。為了使大腸桿菌在發(fā)酵前期更好地生長(zhǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)中添加了少量的磷酸氫二銨作為無(wú)機(jī)氮源。此外在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加少量甜菜堿，以增加菌體抗?jié)B透壓能力。

HBUT-L利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)發(fā)酵液中有4g/L的乳酸，這是因?yàn)橛衩诐{中含了一定量乳酸；0到6h菌體基本不產(chǎn)乳酸，耗糖量很少，加堿量也很少，這段時(shí)間菌體處于延遲期，菌體生長(zhǎng)緩慢，主要合成各種酶以適應(yīng)新環(huán)境；6h之后葡萄糖濃度出現(xiàn)小幅的上升，這可能是發(fā)酵液中某些糖類(lèi)物質(zhì)被菌體產(chǎn)生的酶水解成了葡萄糖。之后葡萄糖含量急劇下降，42h后趨于平穩(wěn)，48h基本被消耗完，50h培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為0.36g/L；菌體產(chǎn)酸速率從6h之后急劇上升，20h左右開(kāi)始減小，42h后趨于零，50h乳酸濃度達(dá)到最大，為112.3g/L。由圖4可知，相應(yīng)的加堿速度先快后慢，50h后停止加堿，發(fā)酵結(jié)束。

圖3 HBUT-L利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.3 Fermentation process curve of HBUT-L using corn steep liquor to produce L-lactic acid

圖4 HBUT-L利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸加堿曲線和pH值Fig.4 Alkali curve and pH profile during fermentation using corn steep liquor to produce L-lactic acid by HBUT-L

HBUT-L可在玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并產(chǎn)L-乳酸，其發(fā)酵結(jié)果與無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基相近。由附表可知，用玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的產(chǎn)量要略高于無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，但發(fā)酵時(shí)間有所延長(zhǎng)，乳酸的產(chǎn)率為2.16g/（L·h），是無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)率的79.7%。此外，玉米漿中含有部分的非葡萄糖碳源，可以被HBUT-L利用并轉(zhuǎn)化成乳酸，使乳酸產(chǎn)量在葡萄糖初始濃度低的條件下最后結(jié)果反而高于無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基。

附表 HBUT-L 在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基和玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基上的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Attached table Comparison of HBUT-L fermentation between inorganic salts fermentation medium and corn steep liquor fermentation medium

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的Escherichia coliHBUT-L菌株在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠快速生長(zhǎng)，并高效利用葡萄糖生產(chǎn)L-乳酸。在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基上，HBUT-L在36 h里可以完全消耗10%的葡萄糖，乳酸產(chǎn)量可達(dá)到97.7g/L，乳酸光學(xué)純度在99%上。

HBUT-L在玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中表現(xiàn)良好的發(fā)酵特性，與無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基相比，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至50h，葡萄糖結(jié)晶廢糖液中的葡萄糖同樣可以完全消耗掉，乳酸產(chǎn)量可達(dá)到108.3g/L，乳酸產(chǎn)率低于無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，為2.16g/（L·h）。丁涓等[14]以玉米漿為主要有機(jī)氮源，進(jìn)行嗜熱乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基，發(fā)酵72h乳酸產(chǎn)量11g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為13.1%。趙壽經(jīng)等[15]利用玉米浸泡水進(jìn)行干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸優(yōu)化研究，發(fā)酵96h乳酸產(chǎn)量達(dá)到68.5g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為85.6%。目前國(guó)內(nèi)用大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的文獻(xiàn)報(bào)道很少，且工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值不大。與其他細(xì)菌利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸相比，HBUT-L乳酸產(chǎn)量高、光學(xué)純度高，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，具有明顯的工業(yè)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。本研究為開(kāi)發(fā)低成本L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。

[1]杜連祥.乳酸菌及其發(fā)酵制品生產(chǎn)技術(shù)[M].天津：天津科技出版，1999.

[2]金其榮.發(fā)酵有機(jī)酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000.

[3]白冬梅，趙學(xué)明，李鑫鋼，等.米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-（+）-乳酸研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工，2002，22（6）：9-13.

[4]汪多仁.乳酸生產(chǎn)的發(fā)展與市場(chǎng)開(kāi)拓[J].甘肅化工，2000，14（4）：145-150.

[5]錢(qián)志良.乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用和市場(chǎng)[J].工業(yè)微生物，2000，31（2）：49-53.

[6]VIJAYAKUMAR J,ARAVINDAN R,VIRUTHAGIRI R.Recent Trends in the Production,Purification and Application of Lactic Acid[J].Chem Biochem Eng Q,2008,22(2):245-264.

[7]田康明，周 麗，陳獻(xiàn)忠，等.L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)和聚L-乳酸的化學(xué)加工[J].中國(guó)生物工程雜志，2011，31（2）：102-115.

[8]李可偉，龐廣昌.乳酸及其代謝工程生產(chǎn)[J].食品科學(xué)，2007，28（2）：621-625.

[9]ZHOU S,SHANMUGAM KT,INGRAM LO.Functional replacement of theEscherichia coliD-(-)-lactate dehydrogenase gene (ldhA) with the L-(+)-lactate dehydrogenase Gene(ldhL)fromPediococcus acidilactici[J].Appl Environ Microb,2003,69(4):2237-2244.

[10]楊登峰，潘麗霞，關(guān) 妮，等.產(chǎn)高純度L-乳酸大腸桿菌基因工程菌的初步研究[J].現(xiàn)代食品科技，2011，26（2）：126-128.

[11]WANG YZ,TIAN T,ZHAO JF,et al.Homofermentativeproduction of d-lactic acid from sucrose by a metabolically engineeredEscherichia coli[J].Biotechnol Lett,2012,34(11):2069-2075.

[12]李文友，趙學(xué)明.玉米漿為有機(jī)氮源的L-乳酸發(fā)酵的研究[J].化學(xué)時(shí)刊，2006，20（9）：61-63.

[13]ZHOU S.Betaine tripled the volumetric productivity of D(-)-lactate byEscherichia colistrain SZ132 in mineral salts medium[J].Biotechnol Lett,2006,28(9):671-676.

[14]丁 涓，魏 敏，張 莉.玉米漿發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2011，32（1）：127-130.

[15]趙壽經(jīng)，朱克衛(wèi)，齊紅彬，等.利用玉米浸泡水發(fā)酵生產(chǎn)L（+）-乳酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（11）：55-58.