旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器膠原支架的制備及復(fù)合軟骨細(xì)胞修復(fù)骨軟骨損傷的初步研究

孫晶，綦惠，陶劍鋒，杰永生，陳磊，程曉光，孫磊

·論著·

旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器膠原支架的制備及復(fù)合軟骨細(xì)胞修復(fù)骨軟骨損傷的初步研究

孫晶，綦惠，陶劍鋒，杰永生，陳磊，程曉光，孫磊

目的以膠原為原料開發(fā)一種小型膠原支架材料，嘗試是否適合旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器來復(fù)合軟骨細(xì)胞，并探討復(fù)合細(xì)胞后修復(fù)軟骨損傷的效果。

膠原； 支架（骨科）； 生物相容性材料；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(4):257-262

鑒于軟骨細(xì)胞和軟骨組織的特殊性，關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)問題是當(dāng)前臨床面臨的一大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)修復(fù)方法形成的新生組織主要是纖維軟骨，不具有正常透明軟骨的機(jī)械特性。應(yīng)用組織工程學(xué)的方法進(jìn)行軟骨修復(fù)是目前的一大進(jìn)步[1-5]。獲取種子細(xì)胞（軟骨細(xì)胞或某種干細(xì)胞），將種子細(xì)胞接種到可降解的支架材料上，構(gòu)建成細(xì)胞-材料復(fù)合物，用于軟骨組織的缺損修復(fù)[4-6]。因此，支架材料的選擇和制備是應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)軟骨損傷的重要環(huán)節(jié)。

膠原作為細(xì)胞生長的依附和支持物能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和移行，與創(chuàng)傷愈合過程關(guān)系密切。膠原的水溶液經(jīng)冷凍干燥后可制得膠原膜，可廣泛用于皮膚創(chuàng)傷和燒傷的修復(fù)、牙周引導(dǎo)膜、皮膚缺陷、骨缺損的修復(fù)、神經(jīng)及血管的修復(fù)、藥物緩釋系統(tǒng)、基因傳遞載體、整形美容、止血、傷口敷料等[7-10]。多孔膠原膜是組織工程常用的支架材料。由于軟骨再生修復(fù)能力有限，本研究應(yīng)用多孔膠原膜作為軟骨修復(fù)的支架材料，采用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的體系，有利于細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的物質(zhì)交換，促進(jìn)軟骨細(xì)胞貼附以及后期軟骨的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 DMEM/F-12 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自韓國Biosharp 公司；胃蛋白酶、II 型膠原酶、胰蛋白酶是美國 Sigma 公司產(chǎn)品；乙酸、戊二醛等為國產(chǎn)分析純試劑；透析袋和培養(yǎng)板分別來自生工生物工程（上海）股份有限公司和美國 Corning 公司。

1.1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱是美國 Thermal 公司的產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡購自日本 Olympus 公司；低溫高速離心機(jī)購自美國 Sigma 公司；真空冷凍干燥機(jī)是美國 Virtis 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.1.3實(shí)驗動物 SPF 級成年 SD 雄性大鼠，體重 250 ～ 300 g，由北京積水潭醫(yī)院動物室提供，許可證號 SCXK（京）2011-0006；清潔級成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體重 2 ～ 2.5 kg，由北京積水潭醫(yī)院動物室提供，許可證號 SCXK（京）2011-0003。

1.2 方法

1.2.1膠原提取 取新鮮成年豬跟腱，去除肌膜與筋膜，生理鹽水反復(fù)沖洗數(shù)次；置入烤箱 35 ℃，12 h 烘干至透明；將跟腱用粉碎機(jī)粉碎至棉絮狀；置入 0.5 mol/L 乙酸中，并加入胃蛋白酶消化，置4 ℃ 冰箱 96 h，在此期間每天定時搖振數(shù)次；去除乙酸膠原溶液外的其他雜質(zhì)，于 4 ℃，離心半徑10 cm，8 000 r/min 離心 20 min，取上清液；將上清液放置在磁力攪拌器中并加入 NaCl（質(zhì)量濃度5％）鹽析 24 h；4 ℃，12 000 r/min，20 min 離心取沉淀；將沉淀物放置在磁力攪拌器中再次溶解于0.5 mol/L 乙酸中。重復(fù)上述鹽析步驟，反復(fù)鹽析、溶解 3 次后，將乙酸-膠原溶液裝入透析帶，用0.01 mol/L，pH 7.4 PBS 緩沖液透析 24 h，重復(fù)3 次，更換蒸餾水透析 24 h，重復(fù) 3 次，至蒸餾水透析液中無 Na+為止。

1.2.2膠原支架的制備 制備 5 cm × 5 cm × 0.5 cm 的鋁制載體模具，對其表面進(jìn)行抗酸、抗氧化涂層處理；取透析后的膠原溶液，離心半徑 10 cm，8 000 r/min 離心 20 min 取沉淀，加入 0.5 mol/L乙酸中，充分使之溶解；膠原液倒入模具內(nèi)，鋪成1 mm 厚的薄層，–80 ℃ 深低溫冰箱中，預(yù)凍 1 h；將預(yù)凍后的膠原模板快速轉(zhuǎn)入程序冷凍干燥機(jī)中，按照預(yù)先設(shè)定好的凍干程序，進(jìn)行冷凍干燥 14 h。即成為 1 mm 厚的膠原載體材料，將膠原膜切成1 mm3的塊狀膠原支架材料。常規(guī)劑量60Co 輻照消毒備用。

1.2.3膠原支架細(xì)胞毒性、生物相容性和降解性的檢測 復(fù)蘇 L929 細(xì)胞，胰酶傳代至第 3 代。將材料浸提液 2 倍稀釋，陽性對照為 64 g/L 苯酚，陰性對照為細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞貼壁 1、3、6 d 后（即第 2 天、第 4 天、第 7 天測值），將陽性對照、陰性對照和材料浸提液各加 100 μl，MTT 20 μl，37 ℃ 孵育 4 h，棄上清。每孔加 DMSO 150 μl，振蕩 10 min。酶標(biāo)儀上，490 nm 波長下測吸光值，取平均值。將膠原支架植入大鼠股部肌肉中，1、3、5 周后取材，組織切片觀察膠原的生物相容性和降解情況。

1.2.4旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 載體經(jīng)60Co 輻照消毒后，放置胎牛血清中 30 min。從胎牛血清中取出載體，超凈臺中 24 h 無菌風(fēng)干。將載體與 106個/ml 濃度的軟骨細(xì)胞在含 10％ 胎牛血清的 DMEM 中共同培養(yǎng) 24 h 后，將載體與細(xì)胞放置旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)腔中，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 14 d，每 3 天半換液一次。

1.2.5軟骨損傷動物模型制備 新西蘭大白兔仰臥于手術(shù)臺上，四肢固定，耳緣靜脈注射0.1％ 的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，膝外側(cè)切口，股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面取軟骨，關(guān)節(jié)平面做直徑 3 mm 的圓形缺損，縱向鉆入 3 mm，深達(dá)骨髓腔，造成關(guān)節(jié)骨軟骨損傷模型。將14 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為2 組，支架組（n = 8）：兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)植入到旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（rotary cell culture system，RCCS）中復(fù)合軟骨細(xì)胞的膠原支架；空白對照組（n = 6）：不進(jìn)行任何植入處理。實(shí)驗過程中對動物的處置符合 2006 年科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗動物的指導(dǎo)性意見》[11]。

2 結(jié)果

2.1 膠原膜制備情況

乙酸處理膠原溶液之后溶液呈渾濁狀態(tài)，應(yīng)用透析袋將液體進(jìn)行透析去除 Na+和其他雜質(zhì)之后，獲得黏稠的膠原凝膠。冷凍干燥之后的膠原膜呈白色，表面光滑，肉眼觀察表面空隙均勻（圖 1）。手工切成邊長為 1 mm 小塊，形成載體后，體視顯微鏡下觀察成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)（圖 2）。

圖1 制備的膠原膜Figure 1 Collagen film

圖2 自制的 RCCS 載體（體視顯微鏡 × 40）Figure 2 RCCS scaffold (stereomicroscope × 40)

2.2 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞與支架旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 24 h 后有部分細(xì)胞與載體相復(fù)合，細(xì)胞的形態(tài)為球形（圖 3A）；48 h后大量細(xì)胞與載體相復(fù)合，細(xì)胞之間相互貼附（圖3B），14 d 后在旋轉(zhuǎn)腔中載體與細(xì)胞相互粘接，載體中細(xì)胞形成團(tuán)塊（圖 3C）。

圖3 倒置相差顯微鏡（× 200）觀察軟骨細(xì)胞與支架旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（A：24 h；B：48 h；C：14 d）Figure 3 Observation of culturing condrocytes with collagen scaffold by inverted phase contrast microscope × 200 (A: 24 h; B: 48 h; C: 14 d)

2.3 生物相容性和降解性的檢測

載體植入大鼠肌肉，HE 染色顯示 1 周、3 周時，材料周圍有一定的炎細(xì)胞浸潤，5 周后材料周圍的炎癥反應(yīng)逐漸消失，但降解達(dá) 60％ 左右（圖 4）。

圖4 載體的組織相容性檢測（HE 染色，× 100）（A：植入大鼠皮下 1 周；B：植入大鼠皮下 3 周；C：植入大鼠皮下5 周）Figure 4 Histocompatibility of the scaffold (Hematoxylin-eosin staining, × 100) (A: Implanted into the skin of rat for 1 week; B: Implanted into the skin of rat for 3 weeks; C: Implanted into the skin of rat for 5 weeks)

2.4 細(xì)胞毒性檢測

材料浸提液與 L929 細(xì)胞作用后，細(xì)胞活性與陰性對照相比沒有顯著差異（表 1）。按照公式：[(OD浸提液－OD陽性對照)/(OD陰性對照－OD陽性對照)] × 100％，數(shù)值 ≥ 100％，為 0 級，證明沒有任何細(xì)胞毒性；數(shù)值在 75％ ～ 100％ 之間，為 1 級，極低細(xì)胞毒性；數(shù)值在 50％ ～ 75％ 之間，為 2 級，低細(xì)胞毒性；小于 50％ 出現(xiàn)一次，即證實(shí)有細(xì)胞毒性。經(jīng)計算，數(shù)值 ≥ 100％，因此，用本方法制備的載體無細(xì)胞毒性。

表1 MTT 法檢測細(xì)胞毒性（吸光度值）Table 1 Determination of cytotoxicity by MTT assay (x±s)

2.5 動物模型體內(nèi)植入

膠原支架復(fù)合軟骨細(xì)胞植入后 4 周，可見缺損處少量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)（圖 5A），對照組僅見少量纖維組織（圖 6A）；12 周，膠原支架復(fù)合軟骨細(xì)胞植入組（圖 5B）可見缺損底部的軟骨細(xì)胞，軟骨下形成骨組織，軟骨缺損接近修復(fù)。對照組（圖6B）僅為纖維組織生成，靠下方的組織逐漸形成骨組織，但軟骨缺損處依然為明顯凹陷狀。

圖5 膠原支架復(fù)合軟骨細(xì)胞植入動物模型（A：植入 4周；B：植入 12 周）Figure 5 Cartilage defects implanted with carrier and chondrocytes (A: 4 weeks after operation; B: 12 weeks after operation)

圖6 對照組軟骨修復(fù)情況（A：術(shù)后 4 周；B：術(shù)后 12 周）Figure 6 Cartilage defects without implantation (A: 4 weeks after operation; B: 12 weeks after operation)

3 討論

軟骨損傷修復(fù)一直以來都是組織工程研究的熱點(diǎn)問題。近年來，用細(xì)胞外基質(zhì)支架修復(fù)軟骨損傷的技術(shù)得到了迅速發(fā)展。但由于軟骨細(xì)胞在傳代擴(kuò)增時，容易喪失表型[12-13]。有報道證明，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，可以較好地維持細(xì)胞的表型[14]。我們設(shè)想，如果利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)有利于維持細(xì)胞表型的特點(diǎn)，開發(fā)一種適宜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的系統(tǒng)的載體，該載體在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中可以良好地貼附軟骨細(xì)胞，又能彌補(bǔ)傳統(tǒng)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器微球載體不利于手術(shù)操作的特點(diǎn)，可為組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨損傷提供一個新的思路。

旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）[14-16]可以模擬太空中的微重力環(huán)境，在 RCCS 模擬的微重力環(huán)境中，細(xì)胞克服重力影響，易于聚集，能夠獲得比普通重力環(huán)境中更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度。而且，微重力環(huán)境也可以使細(xì)胞克服重力影響，更易于貼附在載體表面。細(xì)胞在模擬微重力環(huán)境中有一定程度的三維空間自由，有利于細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間按照組織學(xué)特征相互接觸，有利于細(xì)胞的增殖和分化。正常成人關(guān)節(jié)軟骨主要由 II 型膠原和蛋白多糖組成的基質(zhì)包繞著軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞的形態(tài)和基質(zhì)的產(chǎn)生受復(fù)雜的環(huán)境因素影響。在體外常規(guī)單層軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過程中，二維的環(huán)境和堅硬的基質(zhì)會改變基因表達(dá)和阻止分化，導(dǎo)致細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量有限及去分化等現(xiàn)象。用 RCCS 進(jìn)行人軟骨細(xì)胞載體的體外培養(yǎng)，整個培養(yǎng)容器由電機(jī)驅(qū)動沿水平軸旋轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基以及細(xì)胞顆粒隨容器一起旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞與營養(yǎng)物質(zhì)易于均質(zhì)分布，顯著改善體外培養(yǎng)的營養(yǎng)交換，有利于維持軟骨細(xì)胞的表型和功能[16]。

膠原是脊椎動物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，大量存在于動物的皮膚、骨、肌腱和其他結(jié)締組織中。膠原具有組織同源性和生物可降解性、免疫原性低、生物相容性好等特點(diǎn)，作為細(xì)胞生長的依附和支持物能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和移行，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用[7-10]，是組織工程、藥物控釋、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。我們采用膠原作為原料，制備成 1 mm3的載體，在 RCCS 中，觀察軟骨細(xì)胞對該載體的貼附情況。結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞對該載體有良好的貼附效果。

膠原載體本身又能夠為貼壁依賴性細(xì)胞體外生長提供更大的表面積。這些細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的變化，提供了細(xì)胞聚集、快速三維生長和分化的條件。在本研究中，膠原載體作為支架與軟骨細(xì)胞復(fù)合進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時，24 h 后有部分細(xì)胞與載體相復(fù)合，48 h 細(xì)胞與載體貼附良好，細(xì)胞明顯增殖，96 h 在旋轉(zhuǎn)腔中出現(xiàn)塊狀物體，將其吸出顯微鏡下觀察，為載體與細(xì)胞的混合物共生長。證實(shí)，在 RCCS 系統(tǒng)中，膠原載體可以使軟骨細(xì)胞貼附、伸展、增殖。利用 RCCS 系統(tǒng)以及膠原載體復(fù)合培養(yǎng)技術(shù)有利于細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。

為檢測載體的生物相容性情況，我們首先對載體進(jìn)行細(xì)胞毒性的檢測，該載體的細(xì)胞毒性結(jié)果可以滿足細(xì)胞載體的要求。本研究還將載體植入大鼠股部肌肉中，1、3、5 周后取材，均未見到明顯的炎癥反應(yīng)。同時也觀察到，5 周后支架有明顯的降解。我們分析可能是沒有進(jìn)行交聯(lián)導(dǎo)致了材料過快地降解[17-19]。具有適合的生物降解性是組織工程載體的一個重要特性之一，但是，如何使材料在完全發(fā)揮其修復(fù)損傷的同時達(dá)到降解，目前仍值得進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗在動物模型的構(gòu)建上，鉆孔直徑 3 mm，突破軟骨下骨，對于兔股骨外側(cè)髁已是巨大缺損，觀察孔內(nèi)壁有滲血，能夠確保移植后營養(yǎng)供應(yīng)。之后植入在 RCCS 中復(fù)合了軟骨細(xì)胞的膠原支架。結(jié)果顯示術(shù)后 4 周即有少量軟骨組織在關(guān)節(jié)損傷處形成；12 周后，軟骨細(xì)胞數(shù)量和排布逐漸接近周圍正常的軟骨組織。我們認(rèn)為，本實(shí)驗將軟骨細(xì)胞與膠原支架在 RCCS 中復(fù)合，軟骨細(xì)胞可以在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中與支架良好的結(jié)合，同時，細(xì)胞表型的良好維持，對軟骨缺損的修復(fù)也是有力的因素。

構(gòu)建動物模型并植入體內(nèi)，材料不僅受到各種器官組織的動態(tài)作用，還處于代謝、吸收、酶催化反應(yīng)之中，軟骨細(xì)胞或骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在支架材料上不一定能夠維持其表型和功能，因此，在之后的試驗中我們將繼續(xù)探討軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原支架上復(fù)合之后植入動物軟骨缺損處的修復(fù)軟骨缺損的效果，并進(jìn)一步研究如何維持軟骨細(xì)胞的表型和功能。另一方面的原因可能在于 12 周的時間并不能使深達(dá) 3 mm 的缺損完全修復(fù)，如果時間允許，我們還將探討 24 周以后及更長的時間周期中軟骨缺損修復(fù)的效果。

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Preparation of collagen scaffold for rotary cell culture system and effect on repairing cartilage damages of it with adhension of chondrocytes

SUN Jing, QI Hui, TAO Jian-feng, JIE Yong-sheng, CHEN Lei, CHENG Xiao-guang, SUN Lei

ObjectiveRepair of focal articular cartilage injury may be solved by tissue engineering. The preparation of proper scaffold is one of the most important problems to be solved. The aim of the study was to construct a kind of collagen scaffold, co-culture with L929 cells in rotary cell culture system, and implant into animal models with cartilage damage.MethodsCollagen scaffold was prepared from achilles tendon of pigs. Collagen scaffold was cut into small pieces with the size of 1 mm3and co-cultured with L929 cells in rotary cell culture system, and the cytotoxicity and biocompatibility were tested. Rabbit articular cartilage damage models were prepared and divided into 2 groups: the experimental group treated by scaffold with chondrocytes (n = 8) and control group (n = 6) without treatment. After 4 or 12 weeks, the specimens were extracted after surgery. The effects on repairing cartilage injury were examined with haematoxylin and erosin staining.ResultsThe collagen scaffold exhibited good biocompatibilities, and had no cell toxicity. It was proper to co-culture with chondrocytes in rotary cell culture system. The collagen scaffold with adhension of chondrocytes showed effect of repairing cartilage damage, but still could not completely reconstruct the damage.ConclusionThe collagen scaffold with adhension of chondrocytes can repair cartilage damage in a short period, but it shows less potent effect in a long period, which may be correlated with the rapid degradation of the scaffold. The method of collagen scaffold preparation should be improved in our future work.

Collagen; Braces; Biocompatible materials; Cell culture techniques

SUN Lei, Email: dr_sunlei@263.net

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.002

100035 北京積水潭醫(yī)院放射科（孫晶、程曉光）；100035 北京市創(chuàng)傷骨科研究所（綦惠、陶劍鋒、杰永生、陳磊、孫磊）

孫磊，Email：dr_sunlei@263.net

2012-06-06

方法成年豬跟腱中提取膠原，制備膠原支架，進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測和生物相容性分析。將其切成 1 mm3小塊，置于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼附效果。建立兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，編號后，將 14 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為 2 組：支架材料組（n = 8），兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)植入膠原支架材料和軟骨細(xì)胞；空白對照組（n = 6），不進(jìn)行任何植入處理。進(jìn)行 HE 染色后觀察。

結(jié)果膠原支架呈瓷白色，表面空隙均勻，無細(xì)胞毒性，生物相容性良好，但在體內(nèi)降解較快。在旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器中，支架可以與軟骨細(xì)胞良好結(jié)合。膠原支架植入動物體內(nèi) 12 周，雖未完全修復(fù)缺損，但已有少量軟骨細(xì)胞在缺損處出現(xiàn)，修復(fù)效果優(yōu)于對照組。

結(jié)論制備的膠原支架復(fù)合軟骨細(xì)胞短期內(nèi)有一定的修復(fù)軟骨缺損的能力，長期效果欠佳，可能與膠原支架在體內(nèi)過快降解有關(guān)，尚需對制備方法進(jìn)行改進(jìn)。

Author Affiliations:Department of Radiodiagnosis, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China (SUN Jing, CHENG Xiao-guang); Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035, China (QI Hui, TAO Jian-feng, JIE Yong-sheng, CHEN Lei, SUN Lei)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):257-262