RNA沉默——植物基因組免疫的安全防線

董麗，郭惠珊

中國科學院微生物研究所 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101

2006年，美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院的Craig C. Mello和斯坦福大學醫(yī)學院的Andrew Z. Fire因在RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 研究領域中的杰出貢獻而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。這一事件確立了RNA干擾在真核生物基因表達調控網(wǎng)絡中的主導地位。RNA干擾，又稱RNA沉默 (RNA silencing)，是一種具有核苷酸序列特異性的，能夠導致RNA降解，蛋白翻譯抑制，DNA甲基化，以及異染色質形成的表觀遺傳學效應。RNA沉默現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、渦蟲、錐蟲、果蠅、大鼠、人等真核生物中。自1990年人類發(fā)現(xiàn)RNA沉默現(xiàn)象至今，20多年的探索使植物RNA沉默的理論體系日臻成熟和完善。

1 轉錄后基因沉默 (Post-transcriptional gene silencing，PTGS)

1.1 RNA沉默的發(fā)現(xiàn)

RNA沉默的發(fā)現(xiàn)最早可以追溯到1990年。Jorgensen等向矮牽牛中導入粉紅色素合成相關基因，預期產(chǎn)生顏色更深的紫色牽?；ǎY果發(fā)現(xiàn)許多花朵的顏色變成白色或花白色。分析表明：導入的基因與內源粉紅色素基因同時被沉默，所以被稱為共抑制 (Co-suppression)[1]。這一現(xiàn)象與真菌中的壓制 (Quelling)[2]和動物中的RNA干擾 (RNA interference，RNAi)[3]類似，都是以靶標 mRNA的降解為特征，所以又被稱為轉錄后基因沉默 (Post-transcriptional gene silencing，PTGS)。植物中的 PTGS主要過程如下：外源轉基因mRNA在一種依賴于RNA的RNA聚合酶 RDR6 (RNA DEPENDENT RNA POLIMERASE6) 的作用下形成雙鏈 RNA (dsRNA)，再由一種 RNA酶 III蛋白——Dicer或Dicer-like (DCL，植物中以DCL4為主) 切割，產(chǎn)生21 nt小干擾RNA (Small interference RNA，siRNA)，siRNA 進入含有Argonaut 蛋白 (AGO)的 RISC 復 合 體 (RNA-induced silencing complex)[4-5]，介導與 dsRNA 有序列相似性的mRNA的降解[4,6-7]。之后，RDR6又以siRNA為引物，外源mRNA為模板，合成新的dsRNA，在 DCL作用下產(chǎn)生更多的次級 siRNA；次級siRNA的再循環(huán)使沉默信號得以擴增，在宿主中產(chǎn)生系統(tǒng)性的沉默。

1.2 內源PTGS途徑

外源RNA誘導RNAi的發(fā)現(xiàn)促使人們尋找內源性RNAi的存在。第一個內源小RNA——線蟲lin4，是在1993年發(fā)現(xiàn)的[8]；時隔7年，線蟲中另一個長度為21 nt的let7 RNA被發(fā)現(xiàn)[9]；此后，科研工作者們相繼在線蟲、Hela細胞、果蠅、擬南芥等許多真核模式生物和細胞中找到了數(shù)百種相似的小分子 RNA，并將其稱為 miRNA (microRNA)。這些miRNA在各種生物中對靶標RNA的調節(jié)功能也很保守[10]。miRNA，一般長度為21~22 nt，是由非編碼RNA折疊所形成的、短的、不完全配對的莖環(huán)結構經(jīng)DCL1切割后產(chǎn)生的，小RNA進入AGO1復合體，介導mRNA的降解、翻譯后水平的調控[11-13]。通過 miRNA途徑，生物體能夠動態(tài)的調節(jié)編碼基因的表達水平，以適應不同發(fā)育時期和應對外界環(huán)境刺激的需要。

植物體內還存在另外一種參與 PTGS的小RNA——反式作用siRNA (Trans-acting siRNA，ta-siRNA)。ta-siRNA途徑中的主要環(huán)節(jié)就是次級siRNA的生成[14]。ta-siRNA的前體是一類來源于TAS (ta-siRNA transcript) 基因的非編碼轉錄本。ta-siRNA的產(chǎn)生需要miRNA的參與，miRNA介導的 TAS基因裂解之后，部分殘留的轉錄本被RDR6轉化為dsRNA。dsRNA經(jīng) DCL4切割產(chǎn)生ta-siRNA，ta-siRNA介導其他靶標基因，而非TAS基因的降解，故此被稱為反式siRNA[15-18]。

nat-siRNA (Natural antisense transcripts siRNA) 途徑也是植物內源PTGS途徑的一個重要組成部分。擬南芥基因組編碼2 000多個自然的順-反義基因對，這些內源的順-反義基因轉錄自不同的DNA鏈，各自的轉錄本在3￠末端互補。通常情況下，其中一個基因是組成型表達的，另一個基因僅在特定脅迫條件下被誘導表達，二者形成dsRNA。dsRNA作為DCL的底物，被切割成21~24 nt nat-siRNA。nat-siRNA靶向降解順-反義基因的一個轉錄本，裂解的RNA分子又借助于RDR6和SGS3 (SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3) 的功能被轉化成 dsRNA。然后RDR6/SGS3合成的dsRNA分子被DCL處理成nat-siRNA，進而被用于介導同源 mRNA的沉默[19]。目前的研究結果表明：DCL1、DCL2、DCL4可能在不同的基因對調控中發(fā)揮各自的作用[20-22]。

1.3 RNAi技術

隨著PTGS途徑研究的深入，RNAi技術應運而生。RNAi技術就是利用人工方法向宿主中引入沉默誘導因子，達到降解靶基因轉錄本的目的。常用的方法有很多，如將體外合成的siRNA，或包含其序列的dsRNA，用注射等方法導入宿主細胞中；或者，在宿主體內表達與目的基因相關的 miRNA的前體序列或反向重復RNA (Invert repeat RNA，IR-RNA)，誘導靶基因mRNA降解。再有，研究發(fā)現(xiàn)植物病毒侵染會誘導基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)。利用VIGS原理，將目的基因與病毒載體重組，用以侵染植物也能誘導靶標基因的沉默。IR-RNA法穩(wěn)定、易行；病毒侵染法高效、周期短。因此，二者經(jīng)常被用于基因敲除和RNA沉默機制的研究中。

2 轉錄基因沉默

2.1 植物內源RdDM途徑

除了PTGS，植物體內還存在一種與小RNA相關的轉錄基因沉默 (Transcriptional gene silencing，TGS)[23-25]。由于這里的TGS與DNA甲基化相關，因此相應的機制被定義為RNA介導 的 DNA 甲 基 化 (RNA-directed DNA methylation，RdDM)[26]。RdDM途徑是植物特有的維持基因組穩(wěn)定性的機制，其靶點主要是轉座子、重復序列和編碼短RNA的基因間區(qū)[27]。利用遺傳學和生物化學方法，人們已經(jīng)分離出很多參與RdDM途徑的調控元件。這些元件在以下3個方面的一個或多個點上行使功能：hc-siRNA (Heterochromatic siRNA) 的合成；腳手架 RNA (Scaffold RNA) 的合成；參與siRNA和新生腳手架 RNA互補配對的效應復合體的排布以招募DNA甲基化酶。

siRNA (以24 nt為主)的合成需要Pol IV (RNA polymerase IV)、RDR2和DCL3的參與[28-32]。而腳手架RNA是由RNA聚合酶Pol V或者Pol II合成的[33-37]。與Pol V相比，Pol II傾向于合成基因間區(qū)低拷貝重復位點相關的腳手架RNA[37]。不同的RNA聚合酶在RdDM過程中協(xié)同作用。Pol II合成的腳手架轉錄本可能有助于招募Pol IV和Pol V到RdDM靶點，分別促進siRNA的生成或DNA甲基化。Pol V合成腳手架 RNA的過程需要染色質調節(jié)蛋白DRD1 (DEFECTIVE IN RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1)、染色質鉸鏈結構域蛋白DMS3 (DEFECTIVE MERISTEM SILENCING3) 和 RDM1 (RNA-DIRECTED DNA METHYLATION1) 的參與[36-40]；而Pol II合成腳手架 RNA需要 DRD1，但不需要DMS3[37]，是否需要RDM1還未經(jīng)查考。siRNA和腳手架RNA配對及DNA甲基化酶的招募過程則由AGO4、AGO6或者AGO9、DRD1、Pol V、DMS3 (DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING3)、RDM1和 DNA甲基轉移酶DRM2 (DOMAINS REARRANGED METHYLASE2) 負責[27,38-39,41-45]。細胞學分析結果表明：植物中RdDM途徑對于靶位點的沉默調控具有時空分布的特點。高度重復序列主要聚集于核仁周邊區(qū)，被Pol V介導的RdDM沉默。而對于基因間低拷貝位點，則有兩種情況：分布在核仁周邊區(qū)的，被依賴于 Pol V的RdDM 沉默；散布于核質中的，則成為依賴于Pol II的RdDM沉默靶點[36-37,46]。

目前在擬南芥中還發(fā)現(xiàn)2個反向重復序列與通常用于RNAi的轉基因結構極其相似，有對應的靶點，均能產(chǎn)生21~24 nt的siRNA。其中至少IR71的siRNA能被招募到AGO復合體中介導自身和靶基因的PTGS和RdDM。嫁接實驗表明，這些siRNA能夠進行長距離運輸，并能在目標組織中介導RdDM[47]。

2.2 轉基因誘導的TGS

盡管 RdDM途徑是植物特有的維持基因組穩(wěn)定性的機制，但該途徑最早是在轉基因誘導沉默實驗中被發(fā)現(xiàn)的[23-25]。利用與啟動子同源的序列構建IR轉基因載體，在植物體內轉錄，其產(chǎn)物在細胞核里被加工成24 nt siRNA后，能夠介導相應區(qū)域的DNA甲基化，從而抑制靶基因轉錄。植物中，誘導轉基因和編碼蛋白的內源基因的TGS效率有很大差別[48]。植物基因組中的轉基因很容易被沉默，而且無論有無沉默誘導子，沉默狀態(tài)都可以遺傳[24]。而內源編碼基因只有在誘導子存在的情況下才能被沉默，而且沉默效率遠遠低于轉基因[49-50]。這一特點暗示：盡管存在誘導因子 (24 nt siRNA)，RdDM途徑也不大可能作用于內源編碼基因。

3 RNA沉默的傳遞

在植物中，沉默只有向起始細胞以外傳遞，才能更有效地抑制靶基因表達[51-52]。沉默的傳遞包含3個層面：沉默信號的擴增、傳遞和接收。

現(xiàn)已證明：雙鏈siRNA是RNA沉默的信號之一[53-54]。DCL3或DCL4生成的siRNA通過胞間連絲在細胞間運動；通過韌皮部進行長距離運輸，形成系統(tǒng)性沉默。運動的 21 nt siRNA 與AGO1結合，介導PTGS[6,53,55]；而運動的24 nt siRNA可能與AGO4、AGO6或AGO9結合，介導DNA甲基化或與轉錄基因沉默相關的染色質修飾[43,45]。兩種小RNA在信號接收組織中都可能利用RNA聚合酶Pol IV或RDR的功能，起始信號的擴增過程[56-57]。然而，目前還不能排除siRNA前體RNA，例如dsRNA作為信號的可能。

一般情況下，初級小RNA對靶基因轉錄本的積累僅具有微調作用，例如大部分miRNA與靶 mRNA的關系；若要得到更強的沉默效果，有賴于次級siRNA的合成，即信號的擴增過程。次級siRNA分為兩類，一類是與原始激發(fā)子，如dsRNA相關的siRNA的再生產(chǎn)；另一類來自于原始靶標區(qū)段的兩側 (此現(xiàn)象即所謂的“沉默的漂移”)。二者的生成均需要 RDR6的功能和靶標基因的轉錄[58-60]。而在 TGS過程中，信號擴增伴隨著次級24 nt siRNA的產(chǎn)生和啟動子區(qū)甲基化的擴展，這一過程是通過依賴于 Pol IV-RDR2-DCL3的RdDM途徑逐步完成的。在RdDM途徑突變體rdr2，nrpd1 (NRPD1是Pol IV的大亞基)和dcl3中，次級siRNA消失，DNA甲基化水平明顯下降。Daxinger等在其所使用的外源轉基因 TGS沉默系統(tǒng)中還發(fā)現(xiàn)：甲基化的擴展是從靶點區(qū)向下游單向延伸的[61]。

除了信號的擴增和傳遞過程，植物內源可能還存在一個信號接收系統(tǒng)，以便更好地協(xié)調整個沉默過程。在外源轉基因GFP沉默系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)：RdDM途徑的重要元件NRPD1、RDR2和DCL3以及RDR6可能參與長距離mRNA沉默的信號接收過程[56]。

4 植物內源編碼基因RNA沉默的研究

在自然狀態(tài)下，植物利用miRNA、ta-siRNA和nat-siRNA等途徑，適應不同生理或外界環(huán)境的需要，對部分編碼基因的活性進行調節(jié)。大部分活躍表達的蛋白編碼基因不受 PTGS或 TGS沉默途徑的調節(jié)。當人們利用RNAi手段，向植物中轉入外源誘導因子，誘導內源蛋白編碼基因沉默時發(fā)現(xiàn)：無論誘導PTGS還是TGS，都不能得到預期的效果，更不能產(chǎn)生系統(tǒng)性沉默。內源基因只有置于轉基因構建中，作為轉基因來表達，方能被有效地沉默[23,48,62]。然而，利用RNA病毒攜帶啟動子區(qū)片段，建立針對內源基因的VIGS體系，則沉默效果大大加強[63]。這是因為病毒自身的復制及其在細胞間和系統(tǒng)性的擴散，使沉默誘發(fā)子 (啟動子區(qū)片段) 也同時被不斷的擴增，從而增強對內源基因的沉默效應。

由于植物內源基因很難被沉默，而以往的沉默研究大多借助于外源系統(tǒng)，不能完全體現(xiàn)內源編碼基因在面對沉默誘導因子時的原初反應。因此，對于植物是通過何種方式調控和避免內源蛋白編碼基因的RNA沉默，目前所知甚少。郭惠珊研究員等[64]早期通過一個可誘導的 PDS (Phytoene desaturese) 基因沉默系統(tǒng) (PDSi，包含有沉默誘發(fā)子) 的研究，使這一問題露出了冰山一角。研究發(fā)現(xiàn)：在可誘導沉默的植株中，沉默誘發(fā)子誘導的內源 PDS基因沉默僅限于局部被誘導的組織和極少量系統(tǒng)葉片，不能傳遞到整個植株[64]。我們近期將PDSi株系與RdDM途徑相關突變體drd1、nrpd2和nrpe1進行雜交，發(fā)現(xiàn)在這些基因功能缺失背景下，PDS沉默表型增強。分子遺傳學分析結果表明：在野生型 PDSi植株中，siRNA的合成，DNA甲基化及其從轉錄區(qū)向啟動子區(qū)的傳遞，這些過程都只發(fā)生在外源沉默誘發(fā)子結構上，而內源 PDS靶點不受影響。在3個RdDM突變體中，外源沉默誘發(fā)子轉錄本及相應的siRNA大量積累，甲基化水平顯著低于野生型PDSi株系。我們的實驗結果暗示：植物通過RdDM途徑，加強外源沉默誘發(fā)子的自我沉默，從而阻止沉默信號的繼續(xù)產(chǎn)生，有效地抑制了由沉默誘發(fā)子誘導的內源靶基因轉錄本的沉默。我們的研究揭示了植物對編碼基因正常表達的一種自我保護機制；同時也解釋了利用RNAi手段誘導內源編碼基因沉默經(jīng)常無法達到預期沉默效果這一普遍現(xiàn)象背后的原因。

5 植物中的“自我識別系統(tǒng)”

已有的研究結果表明：盡管與沉默誘發(fā)子存在序列同源性，內源功能基因很難被沉默[23]。我們的研究揭示：誘導內源編碼基因沉默的低效率，與沉默過程中內源靶標上不能產(chǎn)生次級siRNA和DNA的從頭甲基化直接相關[65]。次級siRNA的產(chǎn)生與RDR6等相關，DNA的從頭甲基化則依賴于RdDM途徑，這兩者均不能作用于內源編碼基因[6,27,62]。這些現(xiàn)象都表明：植物體內可能存在一種天然的“自我識別系統(tǒng)”，這是植物利用基因沉默系統(tǒng)避免自身被沉默的最基本的保障。無論對于RdDM相關的TGS過程，還是在依賴于RDR6的PTGS擴展過程，“自我識別”都至關重要。然而，迄今為止，人們仍未揭開“植物自我識別系統(tǒng)”的神秘面紗。有研究者認為：這可能與DNA的甲基化水平相關。我們的研究發(fā)現(xiàn)：與內源靶基因不同，外源轉基因DNA結構有一定程度的甲基化，這可能就是植物識別“自己”或“異己”基因組的重要標志之一[65]。另外，T-DNA本身可能具有與重復序列或病毒相似的DNA區(qū)段 (例如，通常所用的35S啟動子本身就來源于病毒)；或者其插入位點常常與重復序列相毗鄰，導致其更容易被RdDM途徑沉默[66]。

簡言之，植物利用基因沉默機制維持自身基因組的穩(wěn)定性，是通過PTGS和TGS途徑雙管齊下的。對于常規(guī)表達的基因，主要通過miRNA、ta-siRNA和nat-siRNA等沉默途徑進行微調；對于內源轉座子等重復序列，則利用siRNA介導的甲基化途徑使其保持低活性狀態(tài)；對于轉基因或病毒等外源DNA或RNA結構，植物一方面通過PTGS降解相關RNA，另一方面利用RdDM途直接造成其轉錄沉默，從而緩解了其對內源功能基因的PTGS作用。從作用機制上講，后兩者有很多的相似之處。這可能是由于它們具備共同的結構特點，均能被植物的“識別系統(tǒng)”檢測出來的緣故。

6 展望

每一種生物都具有特定的基因組，然而，生物基因組是如何在億萬年的遺傳與變異中，保持相對穩(wěn)定呢？RNA沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與研究，為人類認識這一問題提供了一個新的視角。RNA沉默能夠抑制外源DNA入侵 (病毒、轉基因)[67]；保持內源轉座子、重復序列等的低活性[68-69]；在發(fā)育過程中調節(jié)基因表達[70-71]，是一種重要的基因組免疫機制。

盡管近年來的研究成果豐富了我們對于RNA沉默的知識，然而新的問題不斷產(chǎn)生，原有問題仍然存在。例如，PTGS和TGS途徑中更多調控元件有待發(fā)現(xiàn)；與基因沉默信號傳遞直接相關的調控因子一直沒有找到；在基因組中，什么特征決定了一個位點是否能產(chǎn)生 21~22 nt或24 nt的siRNA？植物內源系統(tǒng)如何識別“自己”和“異己”的DNA分子，從而特異地阻擊外源DNA的進攻？

盡管植物如何識別外源 DNA結構尚不清楚，但是利用轉基因技術遇到以下現(xiàn)象已經(jīng)不足為奇了：用來研究基因功能的過量表達轉基因結構，處于內源RdDM沉默途徑監(jiān)控之下，其真正的過表達功能難以發(fā)揮，常常產(chǎn)生共抑制現(xiàn)象；反之，用于敲除內源基因功能的RNAi構建，其表達也受RdDM途徑的抑制，只能在起始部位發(fā)揮作用，難以向周圍組織傳遞。而長期以來，人們用以研究基因沉默途徑的系統(tǒng)往往與轉基因技術有著千絲萬縷的聯(lián)系，所得出的部分結論可能還有待于后人的重新思索和驗證。

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