明串珠菌的基因研究進(jìn)展

成文玉，金紅星*

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

明串珠菌（Leuconostoc）是異型乳酸發(fā)酵的革蘭氏陽性細(xì)菌[1]，產(chǎn)生乳酸、乙酸、乙醇、CO2以及雙乙酰、乙偶姻和C4化合物等芳香化合物[2]。明串珠菌也是韓國泡菜（kimchi，即朝鮮民族的傳統(tǒng)食品）、德國泡菜和腌菜等發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢細(xì)菌，保持這些產(chǎn)品的質(zhì)量中起著重要作用[3-6]。在風(fēng)味酸奶、發(fā)酵奶油、干酪、Kefir乳（牛奶乳）的生產(chǎn)中均要利用明串珠菌，因此近年來在內(nèi)地對其的研究開始活躍[7]。

在國外明串珠菌的研究熱點主要在于葡聚糖，進(jìn)入21世紀(jì)以來關(guān)于明串珠菌基因的研究主要集中在韓國[8-16]。

明串珠菌在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有如下應(yīng)用：形成干酪孔眼（提高產(chǎn)品質(zhì)量）、生成風(fēng)味物質(zhì)（比如雙乙酰）、益生菌、生成葡聚糖（制造凝膠過濾產(chǎn)品，可以作為血液舒展劑、增稠劑和穩(wěn)定劑）、生成甘露醇（低熱量的甜味劑、理想的賦形劑等食品、醫(yī)藥、輕工和化工上的廣泛應(yīng)用）、水解α-半乳糖苷（拓寬高營養(yǎng)食品的選擇范圍）、代謝產(chǎn)生細(xì)菌素（生物防腐劑）、生成低聚糖（促進(jìn)腸胃中的益生菌增殖、抑制腸道中的病原菌生長繁殖、促進(jìn)腸胃蠕動和改善加工食品的特性）等[7]。

在基因工程中明串珠菌可以應(yīng)用于3個方面：（1）明串珠菌的有用蛋白質(zhì)基因在大腸桿菌或酵母中進(jìn)行表達(dá)，（2）將明串珠菌作為受體菌，其他生物的蛋白質(zhì)基因在明串珠菌中進(jìn)行異源表達(dá)，（3）為了獲得高產(chǎn)菌株，對明串珠菌的染色體進(jìn)行改造。

1 明串珠菌基因的克隆與表達(dá)

在國外對明串珠菌基因的克隆與應(yīng)用較多，涉及到多種基因，大部分以E.coli作為受體菌。HEE KYONG KANG等[17]在畢赤酵母中重組表達(dá)了腸膜明串珠菌的果聚糖蔗糖酶基因，而在E.coli中重組表達(dá)了腸膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶基因[18]。C?Té GL等[19-20]克隆了明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因，并在E.coli中進(jìn)行了表達(dá)。LEE JM等[21-22]克隆了腸膜明串珠菌的乙醇/乙醛脫氫酶和磷酸酮醇酶基因，并在E.coli中進(jìn)行了表達(dá)。HAHN G等[23]克隆了甘露醇脫氫酶基因。NIKEL PI等[24]將腸膜明串珠菌的乙醇/乙醛脫氫酶基因?qū)氲紼.coli中，并通過E.coli的發(fā)酵把甘油轉(zhuǎn)化為乙醇了。HEUSER F等[25]在E.coli（同時重組表達(dá)甘露醇脫氫酶和甲酸脫氫酶）中表達(dá)假腸膜明串珠菌的果糖透性酶基因而提高了甘露醇的產(chǎn)率20%。

在內(nèi)地對明串珠菌基因的研究大部分集中在葡聚糖蔗糖酶基因的應(yīng)用上。發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖時，菌體與產(chǎn)物分離困難、產(chǎn)物分子大小難以控制、雜質(zhì)比較多，而固定化酶法生產(chǎn)葡聚糖可以克服這些不足。用腸膜明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶時，酶的活性較低，使酶的分離純化帶來困難。因此，農(nóng)萬廷等[26-28]克隆了腸膜明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因，并在E.coli中進(jìn)行了表達(dá)；邵彥春等[29]在畢赤酵母中表達(dá)了葡聚糖蔗糖酶。隋姍姍等[30]從酶活力高的腸膜明串珠菌中克隆了蔗糖磷酸化酶基因，并在E.coli中構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)，從而獲得了穩(wěn)定好的工程菌株。

一般以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴增而克隆目的基因，因此需要提取明串珠菌的總DNA。提取總DNA的方法是由乳桿菌的方法改進(jìn)而來的，肽聚糖細(xì)胞壁較厚從而破細(xì)胞困難，因此溶菌酶與SDS聯(lián)合使用，有時培養(yǎng)菌體的培養(yǎng)基中加入細(xì)胞壁弱化劑甘氨酸[31]，還有蛋白難以去除，故使用蛋白酶K。

2 明串珠菌作為受體菌

在食品生物技術(shù)中明串珠菌是表達(dá)不同蛋白的很好的候選菌，因為其具有下列4個特性[32]：（1）是美國FDA認(rèn)可的GRAS（generally recognized as safe，一般認(rèn)為安全）；（2）不產(chǎn)生內(nèi)毒素；（3）在好氧還是厭氧條件下都生長很好；（4）能分泌特異性胞外蛋白（如葡聚糖蔗糖酶）且沒有降解蛋白活性。明串珠菌具有很好的分泌功能，是因為在基因組中存在信號肽（signal peptide）基因序列。

載體和轉(zhuǎn)化方法是明串珠菌的基因工程研究中非常關(guān)鍵的2個因子。

2.1 載體

載體為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。明串珠菌的基因研究中使用的載體有穿梭載體和轉(zhuǎn)座子2種。

（1）穿梭載體：明串珠菌的轉(zhuǎn)基因研究中，一般以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建明串珠菌和E.coli之間穿梭的載體，屬于復(fù)制型載體。為了構(gòu)建適用于明串珠菌遺傳轉(zhuǎn)化的食品級載體，JI YOON CHANG等[33-34]對明串珠菌的隱蔽質(zhì)粒進(jìn)行了特性研究。質(zhì)粒的復(fù)制類型（復(fù)制起點，ori）主要有RCR（滾環(huán)復(fù)制）型和θ型，質(zhì)粒pCC3[33]、pFMBL1[34]和pTXL1[35]屬于θ型，質(zhì)粒pCB18[36]、pIH01[37]、pFR18[38]和pCI411[39]屬于RCR型。攝取過多的D-乳酸對人體健康有不利的影響，為了降低韓國泡菜中的D-乳酸含量，QIN JIN等[40]以穿梭載體pLeuCM為基礎(chǔ)構(gòu)建成重組質(zhì)粒，將L-乳酸脫氫酶基因?qū)氲矫鞔榫惺怪a(chǎn)生L-乳酸，結(jié)果表明產(chǎn)生了大量的L-乳酸，但乳酸的總量沒有發(fā)生變化。

（2）轉(zhuǎn)座子：HYUN-JU EOM等[41]利用病毒的轉(zhuǎn)座子（屬于整合型載體）和轉(zhuǎn)座酶，將氯霉素抗性基因（cat，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶）隨機地整合插入到L.mesenteroidesDRC染色體DNA上，避開了重組質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性，從而建立了遺傳上穩(wěn)定的腸膜明串珠菌。

2.2 轉(zhuǎn)化方法

將外源DNA導(dǎo)入到完整明串珠菌受體細(xì)胞的方法是基于物理學(xué)和生物學(xué)原理建立起來的，是細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移和電擊轉(zhuǎn)化。

（1）細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移：接合（Conjugation）是指通過細(xì)菌細(xì)胞之間的直接接觸導(dǎo)致DNA從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞的過程。這個過程是由接合型質(zhì)粒完成的，其通常具有促進(jìn)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞有效接觸的接合功能以及誘導(dǎo)DNA分子傳遞的轉(zhuǎn)移功能，兩者均由接合型質(zhì)粒上的有關(guān)基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數(shù)載體質(zhì)粒缺少接合功能區(qū)，因此不能直接通過細(xì)胞接合方法轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，然而如果在同一個細(xì)胞中存在著一個含有接合功能區(qū)域的輔助質(zhì)粒，則有些克隆載體質(zhì)粒便能有效地接合轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。因此，首先將具有接合功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與難以用上述轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合作用，最終導(dǎo)致重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。

明串珠菌的轉(zhuǎn)基因研究早期利用接合質(zhì)粒[42-45]進(jìn)行的。TASI HJ等[44-45]利用接合質(zhì)粒把產(chǎn)nisin和發(fā)酵乳糖的基因分別從乳酸鏈球菌轉(zhuǎn)移到明串珠菌中，并進(jìn)行了成功表達(dá)。

（2）電擊轉(zhuǎn)化：絕大多數(shù)乳酸細(xì)菌的原生質(zhì)體難以再生，因此外源DNA的轉(zhuǎn)化大都采用電擊法。把DNA引入細(xì)菌的電擊技術(shù)[46]的發(fā)展極大地便利了重組DNA分子的轉(zhuǎn)化，尤其是在乳酸細(xì)菌中如此。電擊轉(zhuǎn)化法（Electroporation）有稱電穿孔法，細(xì)胞膜的基本成分是磷脂雙分子層，高壓放電產(chǎn)生的脈沖使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆的“微孔”，外源DNA大分子通過這個瞬間的“通道”進(jìn)入細(xì)胞。移去外加電壓后，膜孔在一定時間內(nèi)可以自動修復(fù)，這為外源基因的導(dǎo)入創(chuàng)造了條件。利用這一原理，將細(xì)菌細(xì)胞與外源基因組合置于電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品小室中，然后在一定的電壓條件下進(jìn)行短時間（數(shù)μs）直流電脈沖，電擊后的細(xì)胞被轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選并誘導(dǎo)細(xì)胞的分化。目前使用的電擊儀器種類雖然較多，但按輸出電脈沖的方式大致可分為2類：一類以指數(shù)波形式輸出，一類以方波形式輸出。

明串珠菌的電擊轉(zhuǎn)化一般都是基于乳桿菌和乳球菌的電轉(zhuǎn)化方法而改良的。JB LUCHANSK等[47]最早以電擊法轉(zhuǎn)化了明串珠菌。荷蘭乳品研究所的SILKE DAVID等[48]利用電擊轉(zhuǎn)化法將乳酸乳球菌的磷酸-β-半乳糖苷酶基因?qū)朊鞔榫?，首次獲得了成功表達(dá)。電轉(zhuǎn)化的流程：過夜培養(yǎng)（穩(wěn)定生長前期）→轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)3h～4h（對數(shù)生長前期）→洗滌細(xì)胞→用電轉(zhuǎn)緩沖液懸浮菌體→電擊轉(zhuǎn)化→加入培養(yǎng)基后于30℃孵育→涂布在平板上培養(yǎng)而篩選重組子。電擊轉(zhuǎn)化所用的溶液、離心機轉(zhuǎn)子、離心管和電擊杯都要預(yù)冷，在所有的步驟中細(xì)胞都維持冷藏溫度。電擊轉(zhuǎn)化的影響因子見表1，從表1可知，電擊緩沖液中都含有滲透穩(wěn)定劑—蔗糖，而且還含有除去細(xì)胞壁外多聚糖的MgCl2（除了金正煥和Jensen外），一般在對數(shù)生長前期收集菌體并進(jìn)行濃縮。

2.3 篩選標(biāo)記

無論何種類型的載體都必須帶有一個有效的篩選標(biāo)記確保轉(zhuǎn)化子的檢出。明串珠菌的基因工程中已經(jīng)使用過的篩選標(biāo)記有氯霉素[40-41，53，55]、紅霉素[51，53，56]和四環(huán)素[53]等抗生素抗性。如果將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內(nèi)，由于抗性因子的轉(zhuǎn)移，將帶來生物安全性的嚴(yán)重后果。為了防止使用抗生素抗性標(biāo)記所引起的危害，最有效的辦法是用安全的食品級標(biāo)記替代抗生素抗性標(biāo)記以建立食品級選擇性標(biāo)記的載體。

表1 明串珠菌電擊轉(zhuǎn)化的影響因素[47-54]Table 1.Factors affecting the electroporation of Leuconostoc species

SEON-JU JEONG等[51，55]將α-淀粉酶基因?qū)氲綑幟拭鞔榫校亟M質(zhì)粒以附加體的形式存在于胞質(zhì)中，并獲得了成功表達(dá)。因此，可以將α-淀粉酶基因的表達(dá)盒連接到相關(guān)的質(zhì)粒上，構(gòu)建出攜帶糖類利用標(biāo)記的表達(dá)載體，從而開發(fā)出載體、受體及誘導(dǎo)物均為食品級的表達(dá)系統(tǒng)，食品級的明串珠菌工程菌可直接應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域，有著巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價值。

另外、綠色熒光蛋白也可以作為篩選標(biāo)記。KWANHOONLEE等[57]由p32強啟動子、假植物乳桿菌質(zhì)粒pC7復(fù)制子和綠色熒光蛋白（GFP）構(gòu)建了pCW5載體，并轉(zhuǎn)化明串珠菌，成功表達(dá)了綠色熒光蛋白，且由Western雜交和共聚焦顯微鏡檢查而得到證實。

3 明串珠菌染色體的改造

培養(yǎng)基含有蔗糖時明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)生葡聚糖，從而降低韓國泡菜的品質(zhì)。為了改善韓國泡菜的風(fēng)味，HYUN-JU EOM等[58]構(gòu)建了有效的基因敲除系統(tǒng)，并獲得了鈍化葡聚糖蔗糖酶（蔗糖-6-葡糖基轉(zhuǎn)移酶）活性的菌株。

4 基因組研究

明串珠菌屬中已經(jīng)完成全基因組測序的有9個物種、L.kimchii的2個菌株、腸膜明串珠菌的2個亞種，見表2。從表2可以看出，基因組大小大部分為2Mb左右，蛋白質(zhì)基因的數(shù)量為大約2000個，具有1個或幾個rRNA操縱子。測序工作大部分由韓國人完成的，因為明串珠菌是韓國泡菜的發(fā)酵中起重要作用的乳酸細(xì)菌，所以國家非常重視。

5 展望

（1）如今很多基因的功能注釋是通過生物信息學(xué)軟件的比對結(jié)果而產(chǎn)生的。明串珠菌屬的每個物種中還有不少基因的功能未知，有待于由實驗手段來完成，比如采用基因敲除方法、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)。通過基因敲除使某基因失活而產(chǎn)生突變菌株，并與野生菌株的性狀相比較，從而揭示基因的作用。但經(jīng)內(nèi)源性同源重組而產(chǎn)生基因敲除的幾率偏低，因此工作量很大。由于外源性同源重組而基因被敲除的概率較高，有利于研究進(jìn)程的加速，但必須構(gòu)建相關(guān)的系統(tǒng)才能進(jìn)行基因操作。

表2 明串珠菌屬中已完成全基因組測序的物種[8-16,59]Table 2.Completed genomes of Leuconostoc species

（2）將明串珠菌作為受體菌進(jìn)行了一些轉(zhuǎn)基因方面的探索，但不像E.coli、乳桿菌和乳球菌等細(xì)菌那樣，受體-載體系統(tǒng)還很不完善，還處于研究的起步階段，有待于深入研究。構(gòu)建以非抗生素抗性為標(biāo)記和選擇壓力的“可食性”明串珠菌表達(dá)系統(tǒng)就顯得十分必要。

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