微流控PCR裝置中溫度控制技術(shù)評述*

劉 勇，高 娜，朱 靈，李 飛，王貽坤，張 龍

（中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機械研究所光電子技術(shù)研究室，安徽合肥 230031）

0 引言

20世紀90年代初，Manz A和Widmer H M首次提出微型全分析系統(tǒng)（miniaturized total analysis systems）的概念［1］，其核心是微流控芯片，即以微機電系統(tǒng)（micro-electro-mechanical systems，MEMS）技術(shù)為依托，通過控制微通道中的流體將取樣、預(yù)處理、反應(yīng)、分離和檢測等操作集成在微芯片上進行，實現(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化、集成化、自動化與便攜化［2］。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是Mullis于1985年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。PCR的原理［3］類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，在試管中給DNA的體外合成提供模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、Mg2+、合適的緩沖體系，進行DNA模板的變性，引物與模板的退火和引物的延伸，經(jīng)過多次變性、退火和延伸后，待擴增的DNA分子或者片斷可放大幾十甚至幾百萬倍。

在PCR的熱循環(huán)中，溫度直接影響PCR擴增成功與否，較大的溫度偏差會導(dǎo)致擴增失敗:變性溫度太高會影響DNA聚合酶的活性;退火溫度過低會導(dǎo)致大量非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，而過高又會使擴增效率下降;不合適的延伸溫度也會對擴增產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量造成影響［3］。近年來研究表明［4］:提高PCR熱循環(huán)中3個溫區(qū)之間的升降溫速率，不僅能夠縮短整個PCR擴增過程所需時間，而且特異性更好。微流控芯片為PCR微型化操作提供了一條可行的途徑，較小的反應(yīng)體積不僅可以大大減少試劑消耗還可提高升降溫速率。

1 微流控PCR裝置中加熱方式和冷卻方式

加熱和冷卻方式直接影響溫度的升降溫速率，決定了PCR擴增所需的時間。

1.1 微流控PCR裝置中加熱方式

微流控PCR裝置中采用的加熱方式大致可分為接觸式和非接觸式加熱兩種。接觸式加熱是將加熱源直接與微芯片接觸，以傳導(dǎo)方式對反應(yīng)區(qū)域加熱?？刹捎闷霞傻谋∧ぜ訜嵩玢K（Pt）、銦錫氧化物（Indium Tin Oxide，ITO）等;或外置加熱裝置，如金屬加熱塊、熱電制冷器（thermoelectric cooler，TEC）等。非接觸式加熱可采用紅外輻射加熱、感應(yīng)加熱、微波加熱等。

1.1.1 片上集成薄膜加熱元件

薄膜加熱元件具有體積小、溫度響應(yīng)速度快、控制精度高等優(yōu)勢，廣泛用于微流控PCR裝置中，目前多采用Pt薄膜［5～11］作為加熱元件，升溫速率主要在 10～20 ℃ /s。

此外，ITO也有很大優(yōu)勢，其薄膜厚度在nm數(shù)量級，物理化學(xué)性能穩(wěn)定，與大部分襯底有良好的附著性，另外，ITO薄膜的透光性較好，便于光學(xué)檢測。戴敬等人［12］采用ITO對連續(xù)流動式芯片加熱，20～30 s后溫度上升到設(shè)定值達到穩(wěn)定。

1.1.2 外置加熱裝置

最簡單的外置加熱裝置是利用電熱加熱器加熱銅［13］、鋁［14］等金屬塊。金屬塊作為外置加熱系統(tǒng)具有較大的體積和熱容量，升溫和冷卻速率較慢，從而限制了微反應(yīng)速度。

另外一種常用的外置加熱裝置是熱電制冷器，其溫度響應(yīng)快，變化范圍寬，均勻性好于線形的加熱源，具有較好的應(yīng)用前景［15］。采用單片TEC很難達到要求時，可以多片一起使用［16，17］。Qiu X B 等人［16］將 PCR 微芯片夾在兩片TEC之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，該方法能較好地改善溫度梯度。如果只有單片TEC，PCR微芯片上下表面溫度相差2.5℃，如果采用兩片 TEC，溫度相差0.2℃。

1.1.3 紅外輻射加熱

紅外輻射的物理本質(zhì)是熱輻射，物體的溫度越高，輻射出來的紅外線越多，這些輻射能被其他物體接收后又可轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮苁蛊錅囟壬?，常用的紅外輻射源有鎢絲燈［18，19］、鹵鎢燈［20］等。通過控制紅外輻射波長，采用對紅外輻射吸收較小的材料，選擇性地加熱反應(yīng)液，可以避免反應(yīng)腔熱容量的影響，提高升溫速率，但是需要增加透鏡、濾波片等光學(xué)器件。

1.1.4 感應(yīng)加熱

基于輻射加熱存在的能量效率不高、需要透鏡濾波片等光學(xué)器件的問題，感應(yīng)加熱是一種新的有效的非接觸加熱方法。感應(yīng)加熱［21］單元一般包括電力發(fā)電機、由線圈組成的振蕩回路（儲能電路）和水冷卻系統(tǒng)，線圈的設(shè)計是感應(yīng)加熱方法中一個重要的問題。在Pal D等人［22］設(shè)計的感應(yīng)加熱系統(tǒng)中包括2個線圈:線圈1由直徑2 mm的漆包銅線環(huán)繞在直徑10 mm的鐵氧體磁芯上組成，12 V的電池組提供直流電，交變電流由方波脈沖產(chǎn)生;線圈2是一個由金屬鐵制成的圓環(huán)形加熱器，外徑14mm，內(nèi)徑5mm，4塊PCR微芯片通過高溫粘結(jié)在金屬加熱器上，升溫速率為6.5℃/s，該方法裝置簡單，低功耗，便于開發(fā)手攜式設(shè)備。

1.1.5 微波加熱

Fermér C等人［23］首次介紹了微波加熱，文中提到微波加熱有如下特點:沒有熱慣性，能量高度集中;溫度梯度小，能加速PCR反應(yīng);25個循環(huán)后DNA聚合酶仍有活性。Shaw K J等人［24］用銅塊做成微波腔，升溫速率能達到65℃/s。Shah J J等人［25］在微流體通道集成薄膜微波傳輸線對流體進行加熱，通過調(diào)節(jié)微波的激發(fā)頻率即可改變微波的功率，從而控制溫度。此外，調(diào)整微波傳輸線的位置可以對區(qū)域選擇性加熱。

1.1.6 其他加熱方式

Guijt R M等人［26］利用濃硫酸溶于水放熱的原理來加熱，裝置簡單，不需要額外的微機電加工過程，但是升溫速率較慢（1℃/s）。Shen K Y等人［27］通過柔性印刷電路技術(shù)制作了一種薄膜銅電阻加熱器，升溫速率為8℃/s，該方法裝置簡單，輕便，低成本，低功耗，熱耗散能力強。

1.2 微流控PCR裝置中冷卻方式

微流控PCR裝置中冷卻方式可采用自然對流或強制對 流，其 中 強 制 對 流 可 外 接 壓 縮 空 氣 源［24，25］或 風(fēng)扇［5，8，9，14，19，20，27，29］，對較小的加熱區(qū)域外接壓縮空氣源冷卻效果比風(fēng)扇好。強制對流方式冷卻速率較大，但是因為外接制冷系統(tǒng)會增加體積，集成化的程度較低。自然對流無需外界提供動力源，集成化程度較高，但速率比較低，還受周圍溫度的影響。Guijt R M等人［26］利用物理方法來制冷，通過丙酮蒸發(fā)吸熱將熱量帶走，冷卻速率較慢（1℃/s）。

2 微流控PCR裝置中溫度的測量方式

2.1 接觸式測溫

使測量體與被測介質(zhì)接觸、依靠傳熱或?qū)α鬟M行熱交換并達到熱量平衡的測溫方法稱為接觸式測溫方法。接觸式測溫元件可以分薄膜型和非薄膜型測溫元件，薄膜型傳感器常和加熱器合二為一，集成在PCR微芯片上，主要是Pt［5，7，9，10，11］，Pt電阻的阻值與溫度呈近似線性關(guān)系，可以直接有效地對器件的溫度進行測量。非薄膜型測溫元件種類較多，其中應(yīng)用較多的是熱電偶［14，16，22，24］。接觸式測溫主要優(yōu)點是方法簡單，可靠，測量精度較高。但是測溫元件與被測反應(yīng)液直接接觸，會造成交叉污染。若與反應(yīng)腔接觸，又不能反映微流體內(nèi)局部溫度變化。此外，測溫需經(jīng)歷熱量的交換與平衡過程，會導(dǎo)致測溫過程的延遲，也會將測溫元件的熱容量添加到其中，影響其溫度。

2.2 非接觸式測溫

為了克服接觸式測溫遇到的問題，一些研究者嘗試去開發(fā)非接觸式測溫的方法，如紅外輻射溫度計［19］。紅外輻射測溫不需要任何傳遞媒介、不需要直接接觸即可測溫，測溫速度快且不會對被測物產(chǎn)生大的干擾。其缺點是容易受外界因素的干擾，導(dǎo)致測量誤差大，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價格昂貴。

以上的方法都只能反映局部溫度，不能觀察溫度的空間分布情況，為了獲得空間的實時的溫度分布信息，又出現(xiàn)了其他新的方法，如熱致變色液晶（thermochromic liquid crystal，TLC）測溫技術(shù)［9］、指示劑熒光強度變化測溫技術(shù)［12，18，25，29，30］，將 TLC 或指示劑添加到 PCR 反應(yīng)液中，由溫度變化導(dǎo)致的TLC顏色的變化或熒光強度的變化可以反映整個PCR反應(yīng)腔內(nèi)的溫度情況。

3 結(jié)論

綜上所述，接觸式加熱體積小，集成化程度高，容易實現(xiàn)微型化和便攜化，但添加了額外的熱容量，不利于熱循環(huán)的快速進行;非接觸式加熱克服了接觸式加熱的主要缺點，加熱元件的熱容量不再參加PCR反應(yīng)體系的溫度循環(huán)，升溫度速率一般要優(yōu)于接觸式加熱，但非接觸式加熱的設(shè)備一般比較大，相對復(fù)雜，價格昂貴。采用自然冷卻不需要任何外置設(shè)備，但是冷卻速率較慢，通常還是外接風(fēng)扇或是壓縮空氣源強制對流來加快冷卻。接觸式測溫雖然簡單可靠，但并不能實時反映被測介質(zhì)的溫度，也不能反映整個區(qū)域的溫度分布情況。通過添加TLC或熒光染料，找到其與溫度的相關(guān)性，將測溫轉(zhuǎn)換為觀察TLC的顏色或測熒光染料的熒光強度來實現(xiàn)，能實時反映溫度的空間分布和隨時間的變化率，為溫度的測量提供了一種很好的方法。

從集成化、微型化、便攜化的角度來看，更多的還是采用集成薄膜元件來加熱和測溫，常將Pt薄膜集成在PCR微芯片底部，集加熱和測溫于一體。

［1］Manz A，Graber N，Widmer H M.Miniaturized total chemical analysis systems:A novel concept for chemical sensing［J］.Sensors and Actuators B，1990，1（1）:244 －248.

［2］方肇倫.微流控分析芯片的制作及應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:1－8.

［3］馬建崗.基因工程學(xué)原理［M］.2版.西安:西安交通大學(xué)出版社，2007:82－96.

［4］Wittwer C T，Garling D J.Rapid cycle DNA amplication:Time and temperature optimization［J］.Biotechniques，1991，10（1）:76－83.

［5］Zhang C S，Xu J L，Ma W L，et al.PCR microfluidic devices for DNA amplification［J］.Biotechnology Advances，2006，24（3）:243－284.

［6］Wang Z，Sekulovic A，Kutter J P，et al.Towards a portable microchip system with integrated thermalcontroland polymer waveguides for real-time PCR［J］.Electrophoresis，2006，27:5051－5058.

［7］Kaigala G V，Hoang V N，Stickel A，et al.An inexpensive and portable microchip-based platform for integrated RT-PCR and capillary electrophoresis［J］.Analyst，2008，133（3）:331 －338.

［8］Zhong R T，Pan X Y，Jiang L，et al.Simply and reliably integrating microheaters/sensors in a monolithic PCR-CE microfluidic genetic analysis system［J］.Electrophoresis，2009，30（8）:1297－1305.

［9］Dinca M P，Marin G，Aherne M，et al.Fast and accurate temperature control of a PCR microsystem with a disposable reactor［J］.Journal of Micromechanics and Microengineering，2009，19（6）:960－1017.

［10］Lien K Y，Lee S H，Tsai T J，et al.A microfluidic-based system using reverse transcription polymerase chain reactions for rapid detection of aquaculture diseases［J］.Microfluidics and Nanofluidics，2009，7:795 －806.

［11］Kim S J，Wang F，Burns M A，et al.Temperature-programmed natural convection for micromixing and biochemical reaction in a single microfluidic chamber［J］.Analytical Chemistry，2009，81（11）:4510－4516.

［12］戴 敬，樊曉峰，方 瑾，等.微流控芯片系統(tǒng)中測溫及控溫裝置的研制［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（1）:148 －152.

［13］Frey O，Bonneick S，Hierlemann A，et al.Autonomous microfluidic multi-channel chip for real-time PCR with integrated liquid handling［J］.Biomedical Microdevices，2007，9（5）:711 － 718.

［14］Scherer J R，Liu P，Mathies R A.Design and operation of a portable scanner for high performance microchip capillary array electrophoresis［J］.Review of Scientific Instruments，2010，81（11）:1131055－1131057.

［15］Shaw K J，Joyce D A，Docker P T，et al.Development of a realworld direct interface for integrated DNA extraction and amplification in a microfiuidic device［J］.Lab on a Chip，2011，11:443 －448.

［16］Qiu X B，Mauk M G，Chen D F，et al.A large volume，portable，real-time PCR reactor［J］.Lab on a Chip，2010，10:3170 －3177.

［17］Matsubara Y，Kerman K，Kobayashi M，et al.Microchamber array based DNA quantification and specific sequence detection from a single copy via PCR in nano-liter volumes［J］.Biosensors Bioelectronics，2005，20（8）:1482 －1490.

［18］Christopher J E，Karlinsey J M，Landers J P.On-chip pressure injection for integration of infrared-mediated DNA amplification with electrophoretic separation［J］.Lab on a Chip，2006，6:601 － 610.

［19］Michael G R，Christopher J E，Lindsay A L，et al.Infrared temperature control system for a completely noncontact polymerase chain reaction in microfluidic chips［J］.Analytical Chemistry，2007，79:1294－1300.

［20］Ke C，Berney H，Mathewson A，et al.Rapid ampliflcation for the detection of mycobacterium tuberculosis using a non-contact heating method in a silicon microreactor based thermal cycler［J］.Sensors and Actuators B，2004，102:308 －314.

［21］Benedikt J K，Webb D P，Liu C Q，et al.Low frequency induction heating for the sealing of plastic microfluidic systems［J］.Microfluidics and Nanofluidics，2010，9:243 －252.

［22］Pal D，Venkataraman V.A portable battery-operated chip thermocycler based on induction heating［J］.Sensors and Actuators A，2002，102:151 －156.

［23］Fermér C，Nilsson P，Larhed M.Microwave-assisted high-speed PCR［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2003，18:129－132.

［24］Shaw K J，Docker P T，Yelland J V，et al.Rapid PCR amplification using a microfluidic device with integrated microwave heating and air impingement cooling［J］.Lab on a Chip，2010，10:1725－1728.

［25］Shah J J，Geist J，Gaitan M.Microwave-induced adjustable nonlinear temperature gradients in microfluidic devices［J］.Journal of Micromechanics and Microengineering，2010，20（10）:960 －1017.

［26］Guijt R M，Dodge A，Gijs W K van Dedem，et al.Chemical and physical processes for integrated temperature control in microfluidic devices［J］.Lab on a Chip，2003，3:1 －4.

［27］Shen K Y，Chen X F，Guo M，et al.A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology［J］.Sensors and Actuators B，2005，105:251 －258.

［28］Wu J B，Cao W B，Wen W J，et al.Polydimethylsiloxane microfluidic chip with integrated microheater and thermal sensor［J］.Biomicrofluidics，2009，3（1）:1932 －1058.

［29］Selva B，Mary P，Jullien M C.Integration of a uniform and rapid heating source into microfluidic systems［J］.Microfluidics and Nanofluidics，2010，8:755 －765.

［30］Samy R，Glawde T，Ren C L.Method for microfluidic whole-chip temperature measurement using thin-film poly（dimethylsiloxane）/Rhodamine B［J］.Analytical Chemistry，2008，80:369 －375.