用于農(nóng)藥殘留快速檢測的酶生物傳感器研究進(jìn)展*

王明珠，徐 斐，曹 慧，于勁松

（上海理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究所，上海 200093）

0 引言

當(dāng)前，農(nóng)藥的濫用對(duì)人類健康和環(huán)境產(chǎn)生很大威脅，傳統(tǒng)的氣相液相色譜檢測方法準(zhǔn)確可靠，適用于各種溶液的樣品，不足之處在于檢測設(shè)備昂貴、程序復(fù)雜、響應(yīng)時(shí)間長、專業(yè)技術(shù)性強(qiáng)、檢測成本高等。隨著現(xiàn)代分析化學(xué)和微電子技術(shù)的提高，農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)得到迅速的發(fā)展，酶生物傳感器作為一種可以實(shí)時(shí)在線監(jiān)測農(nóng)殘量的儀器具有較大的研究價(jià)值。

目前，對(duì)酶生物傳感器的研究已較為廣泛，信號(hào)轉(zhuǎn)換元件已發(fā)展成熟，但生物敏感元件的選擇性、靈敏度、檢測限、穩(wěn)定性、響應(yīng)時(shí)間以及可重復(fù)性等仍影響著生物傳感器的市場化應(yīng)用，所以，達(dá)到實(shí)用化階段的產(chǎn)品還較少［1］。本文針對(duì)酶生物傳感器中使用較廣泛的酶的種類、酶的固定化技術(shù)以及酶生物傳感器在實(shí)際樣品檢測中的障礙和發(fā)展趨勢做一概述，以便為后續(xù)研究提供參考。

1 檢測用酶的種類

1.1 膽堿酯酶

膽堿酯酶（Cholinesterase，ChE）是檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥（organophosphate insecticides，OPs）廣泛使用的酶，依其催化底物的特異性分為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），ChE對(duì)有機(jī)磷的檢測是基于酶抑制原理。OPs使ChE磷?；蠼档土薈hE催化底物的活性，通過比較有無OPs時(shí)酶催化底物水解的反應(yīng)速率得到OPs對(duì)酶的抑制率，抑制率與OPs的濃度成一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而可以測得OPs的有無和濃度大小。

國內(nèi)外學(xué)者在ChE篩選方面做過大量工作，實(shí)驗(yàn)表明:AChE和BChE對(duì)不同農(nóng)藥的檢測限是不一樣的［2］，此外，不同來源的同一種酶對(duì)農(nóng)藥的檢測限也不同，余孝穎等人比較了家蠅、電鰩和雞肝AChE對(duì)敵敵畏的檢測限，表明家蠅 AChE 對(duì)敵敵畏的檢測限最低，在1.1 ×10－7以下［3］，但家蠅的飼養(yǎng)困難，材料的獲得受到限制。另有文獻(xiàn)報(bào)道［4～6］，用肝臟組織和血清已經(jīng)成功提取純化出較高比活力的ChE，固定后對(duì)對(duì)氧磷和克百威的檢測限分別為1.65 × 10－10和4.68 ×10－11。鑒于從動(dòng)物肝臟和血清中提取ChE簡便、快速、活力回收高、原材料豐富，是目前為止酶生物傳感器中應(yīng)用最廣的ChE酶源。

除了動(dòng)物來源的ChE外，紀(jì)淑娟等人從植物—豬腰豆幼苗中提取的AChE對(duì)敵敵畏、氧化樂果、滅多威的檢測限均低于國標(biāo)規(guī)定的允許殘留限量，可以滿足農(nóng)藥殘留快速檢測的要求［7］，目前，對(duì)其他植物ChE在生物傳感器中的利用正在研發(fā)中。

綜上所述，ChE用于檢測OPs有諸多優(yōu)點(diǎn)，如，來源廣泛、便于提取、檢測靈敏度高，檢測限甚至能達(dá)到10－11，但是基于受農(nóng)藥抑制的酶為基礎(chǔ)做成的生物傳感器其固有缺點(diǎn)是:1）操作程序繁瑣，需要預(yù)抑制時(shí)間;2）特異性較差，干擾信號(hào)多;3）不可逆抑制使酶活喪失嚴(yán)重。

1.2 有機(jī)磷水解酶

另外一種較常用的酶是有機(jī)磷水解酶（organophorus hydrolase，OPH），其檢測原理是OPH能以O(shè)Ps為底物催化水解其中的 P—O，P—F，P—S，P—CN 鍵產(chǎn)生酸和醇，從而導(dǎo)致反應(yīng)體系中pH的變化，這種變化可以被轉(zhuǎn)換成可測量的電或光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)OPs濃度的測定。

OPH廣泛分布于哺乳動(dòng)物、昆蟲和微生物體內(nèi)，和ChE一樣，來源于不同生物和同一生物不同組織的OPH水解OPs的種類和能力是不同的，其中微生物體內(nèi)的OPH活性報(bào)道較多，國內(nèi)外學(xué)者已從多種細(xì)菌、藻類、霉菌中分離篩選出OPH［8］，但由于OPH是胞內(nèi)酶，提取技術(shù)尚不成熟，目前使用的OPH多提取自天然畢赤酵母菌株，但天然菌株中含量太低，生產(chǎn)成本高，這也是導(dǎo)致用OPH檢測OPs研發(fā)較晚和進(jìn)展緩慢的重要原因［9］。

以O(shè)PH為檢測用酶做成的電流型傳感器反映的是各種OPs的信號(hào)［10］，而電位型傳感器僅反映能產(chǎn)生對(duì)硝基酚的OPs，Sch?ning M J據(jù)此原理設(shè)計(jì)的電流—電位型傳感器可實(shí)現(xiàn)兩類農(nóng)藥的區(qū)別檢測，檢測限在10×10－7級(jí)，為農(nóng)藥多殘留檢測提供了新的思路［11］。

OPH的優(yōu)點(diǎn)是分析物本身即作為底物參與反應(yīng)，不需要預(yù)抑制時(shí)間;只水解OPs，選擇性強(qiáng);檢測中酶活損失少，可重復(fù)利用。缺點(diǎn)是OPH檢測靈敏度普遍比ChE低，儀器核心芯片制作復(fù)雜，裝置生產(chǎn)成本較高，且在天然畢赤酵母菌株中含量太低。

1.3 基因改造酶

前文介紹的2種常用酶應(yīng)用于生物傳感器上存在一定缺陷，比如:存在擴(kuò)散阻礙、選擇性低、對(duì)環(huán)境敏感、靈敏度低、檢測限高、生產(chǎn)成本高等。為改善這些缺陷，近年利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)較理想的新型生物酶成為研究熱點(diǎn)。通過堿基替換、插入、剪切以及組合突變等方法［12～15］，已篩選出具有有機(jī)溶劑耐受性、選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢的ChE，此外，將OPH基因?qū)胛⑸矬w內(nèi)并胞外表達(dá)得到的OPH也成功應(yīng)用在酶傳感器中［16］，大大降低了OPH的生產(chǎn)成本。

1.4 其他酶類

除上述提到的2種較常用的酶之外，還有一些酶類由于能被農(nóng)藥抑制而應(yīng)用于酶傳感器中，如，酪氨酸酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、乙酰乳酸合酶、乙醇脫氫酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶［17～23］等。本文［24］比較了不同濃度的幾種農(nóng)藥對(duì)商品AChE和自制雞肝酶中總酯酶活力的抑制情況。結(jié)果表明:雞肝中多功能氧化酶的存在使其具有更低的農(nóng)藥含量檢出限，靈敏度與AChE接近且來源廣泛、提取簡便、價(jià)格低廉，是一種優(yōu)良的農(nóng)藥檢測用酶。

2 酶生物傳感器中酶的固定化技術(shù)

酶生物傳感器最主要的元件是固定化酶，因此，除了酶本身的性質(zhì)外，酶的固定化技術(shù)一直是生物傳感器研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。它既要保持酶的固有特性，又要避免其應(yīng)用上的缺陷。固定方法主要有以下幾種:

2.1 交聯(lián)固定法

交聯(lián)法結(jié)合牢固，應(yīng)用較多，交聯(lián)劑使用最多的是戊二醛，實(shí)驗(yàn)表明:戊二醛熏蒸法與浸泡法相比得到的固定化酶膜較薄，且酶膜越薄，對(duì)農(nóng)藥的敏感度越高，檢測限越低［25］。除戊二醛外，目前還有采用丙烯晴、聚乙二醇、雙醛淀粉［26］等末端有功能集團(tuán)的長鏈做交聯(lián)劑的研究，這種柔性的交聯(lián)劑可以減少酶在固定化過程中因剛性碰撞導(dǎo)致的失活，且提高了酶的固定化速度。

近年來有大量實(shí)驗(yàn)研究將AChE、有機(jī)磷水解酶、酪氨酸酶［10，18，27］等以戊二醛為交聯(lián)劑固定在新型載體—納米材料修飾的電極上，納米材料具有良好的生物兼容性且活性極高，可以有效地促進(jìn)酶和電極之間的電子傳遞［28］，大幅降低氧化還原反應(yīng)的過電位，納米材料以其獨(dú)特的優(yōu)勢已成為酶生物傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2.2 包埋法

包埋法突出的優(yōu)點(diǎn)是酶分子未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，活力保持較高，且由于基質(zhì)的保護(hù)作用，固定化酶的儲(chǔ)存期較長，Andreescu S的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:溶膠—凝膠法包埋AChE在－20℃可保存6個(gè)月，聚乙烯醇—苯乙烯吡啶包埋酶在4℃可穩(wěn)定保存8個(gè)月。但凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的擴(kuò)散阻力較大，只有小分子的底物和產(chǎn)物可以通過。適當(dāng)控制包埋條件可減小這種擴(kuò)散抑制，Sotiropoulou S等人［29］通過傅里葉變換紅外光譜法和電化學(xué)阻抗光譜分析了AChE在溶膠凝膠中的流動(dòng)機(jī)理，發(fā)現(xiàn)正硅酸乙酯與水混合比為1∶0.5時(shí)，固定酶膜疏水性最強(qiáng)，此條件下固定酶穩(wěn)定性好、泄漏少、活性幾乎沒有損失，對(duì)底物響應(yīng)只需約30 s，對(duì)敵敵畏檢測靈敏度大大高于其他溶膠—凝膠固定酶制備的EBS。

2.3 結(jié)合使用法

為克服單一固定化方法的缺點(diǎn)，常采用2種或多種技術(shù)結(jié)合的方法，如吸附—包埋、吸附—交聯(lián)、包埋—共價(jià)結(jié)合、共價(jià)—交聯(lián)［30～32］等。Chough S H［33］先將 OPH 和牛血清白蛋白吸附于尼龍網(wǎng)上，再使用戊二醛熏蒸將酶與載體通過化學(xué)鍵連接，得到的固定化酶酶活保留率高且結(jié)合牢固，性質(zhì)穩(wěn)定。近年來，納米材料的引入使得該方法具有廣闊的應(yīng)用前景［34］，納米材料較高的酶富集效率使吸附在其上的酶量大幅增加，且由于納米材料有極強(qiáng)的電子傳遞能力使交聯(lián)后的固定化酶對(duì)底物和產(chǎn)物的響應(yīng)較快。

2.4 其他方法

除上述較常用的固定方法外，酶的固定還有共價(jià)結(jié)合法和吸附法。共價(jià)結(jié)合法結(jié)合較牢固，但載體的活化過程很復(fù)雜，反應(yīng)條件也較劇烈，要獲得較高活力的固定化酶需要嚴(yán)格控制條件，因此，應(yīng)用較少。吸附法固定條件溫和，酶活保留率較高［35］，但制得的固定酶與載體相互作用力弱、容易脫落，因此，吸附法一般與包埋、交聯(lián)等方法結(jié)合使用。

以上固定化方法涉及多點(diǎn)結(jié)合，分子排列的隨機(jī)性導(dǎo)致酶的空間構(gòu)型被破壞，使酶活性損失或產(chǎn)生擴(kuò)散抑制等。針對(duì)上述問題，定向固定化技術(shù)（oriemed immobilization）發(fā)展起來。利用該技術(shù)制得的酶傳感器對(duì)農(nóng)藥具有極高的敏感性和極低的檢測限［36］，對(duì)氧磷的檢測限達(dá)10×10－13，低于其他方法固定化酶的檢測限，定向固定化技術(shù)剛起步不久，相關(guān)的研究也較少，但其優(yōu)良的檢測性能顯示了該固定技術(shù)巨大的應(yīng)用前景。

3 結(jié)束語

盡管國內(nèi)外研究者在酶生物傳感器領(lǐng)域做了諸多努力，其在農(nóng)藥殘留在線分析應(yīng)用上仍然存在一些缺點(diǎn)，例如:1）基于酶抑制原理制得的傳感器選擇性低，因此，目前的EBS檢測只是針對(duì)加入單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品，在實(shí)際樣品中的應(yīng)用很少;2）酶電極重復(fù)使用率低，再生較困難，且再生成本較高;3）檢測限偏高，康天放［37］設(shè)計(jì)的酶電極在每次測定后簡單拋光即可重新固定使用，重復(fù)使用率較高，但對(duì)樂果和克百威的檢測限高于國家農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn);4）農(nóng)藥提取率低，易造成假陰性結(jié)果，張淑平［38］以戊二醛交聯(lián)固定AChE制成的傳感器檢測加標(biāo)蔬菜中農(nóng)藥含量，檢測性能優(yōu)良，但回收率只有70%左右，而傳統(tǒng)的氣相色譜法接近100%;5）固定化酶還存在對(duì)有機(jī)溶劑耐受性差和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性低等缺點(diǎn)。

盡管如此，酶生物傳感器可以在線連續(xù)監(jiān)測、預(yù)處理簡單，具有傳統(tǒng)的氣相液相色譜法無法企及的的優(yōu)勢，仍不失為一種優(yōu)良的檢測農(nóng)殘的方法，正向著高度自動(dòng)化、微型化與集成化的方向蓬勃迅速地發(fā)展。

［1］劉真真，張 敏，姚海軍，等.酶生物傳感器的研究進(jìn)展［J］.東莞理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，14（30）:97 －101.

［2］Marty J L，Garcia D，Rouillon R.Biosensors:Potential in pesticide detection［J］.Trends Anal ChEm，1995，14（7）:329 －333.

［3］余孝穎.有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)不同生物來源的膽堿醋酶選擇性抑制的研究［J］.環(huán)境科學(xué)，1996，17（4）:41 －43.

［4］劉 暢，陳福生，李書謙，等.鴨血漿膽堿酯酶的分離純化和性質(zhì)的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（4）:91 －94.

［5］Albareda－Sirvent M，Merkoci A，Alegret S.Pesticide determination in tap water and juice samples using disposable amperometric biosensors made using thick－film technology［J］.Analytica Chimica Acta，2001，442:35 －44.

［6］丁運(yùn)華，陳勇智.用于檢測農(nóng)藥殘留的膽堿酯酶酶源的研究進(jìn)展［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，27（5）:73 －77.

［7］紀(jì)淑娟，秦奉達(dá)，白 冰.豬腰豆幼苗中乙酰膽堿酯酶和酯酶活性及其對(duì)農(nóng)藥的敏感性［J］.食品科學(xué)，2011，32（11）:39－42.

［8］王麗紅.有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的生物降解和OPH法檢測研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2006.

［9］王麗紅，張 林，陳歡林.有機(jī)磷農(nóng)藥酶生物傳感器研究進(jìn)展［J］.化學(xué)進(jìn)展，2006，18（4）:440 －452.

［10］Chough S H，Mulchandani A，Mulchandani P，et al.Organophosphorus hydrolase－based amperometric sensor:Modulation of sensitivity and substrate selectivity［J］.Electroanalysis，2002，14（4）:273－276.

［11］Sch?ning M J，Krause R，Block K，et al.A dual amperometric/potentiometric FIA－based biosensor for the distinctive detection of organophosphorus pesticides［J］.Sensors and Actuators，2003，95:291－296.

［12］Sotiropoulou S，F(xiàn)ournier D，Chaniotakis N A.Genetically engineered acetylcholinesterase－based biosensor for attomolar detection of dichlorvos［J］.Biosens Bioelectron，2005，20:2347 －2352.

［13］Devic E，Li D，Dauta A，et al.Detection of anatoxin－a（s）in environmental samples of cyanobacteria by using a biosensor with engineered acetylcholinesterases［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68:4102－4106.

［14］Valdes－Ramirez G，F(xiàn)ournier D，Ramirez－Silva M T，et al.Sensitive amperometric biosensor for dichlorovos quantification:Application to detection of residues on apple skin［J］.Talanta，2008，4:741 －746.

［15］Schulze H，Schmid R D，Bachmann T T.Activation of phosphorothionate pesticides based on a cytochrome P450 BM－3（CYP102－A1）mutant for expanded neurotoxin detection in food using acetylcholinesterase biosensors［J］.Anal ChEm，2004，76:1720 －1725.

［16］Joshi K A，Prouza M，Kum M，et al.V－type nerve agent detection using a carbon nanotube－based amperometric enzyme electrode［J］.Anal ChEm，2006，78（1）:331 －336.

［17］曲云鶴，肖飛程，欲曉施.Tyr/Glu/Fe3O4/Nafion/CNT/GCE酪氨酸酶生物傳感器的制備及應(yīng)用于農(nóng)藥檢測的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，68（6）:535 －539.

［18］李 娜，魯曉翔.酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（7）:406 －409.

［19］Mazzei F，Botre F，Montilla S，et al.Alkaline phosphatase inhibition based electro ChEmical sensors for the detection of pesticides［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，2004，574:95 －100.

［20］Van Dyk J S，Pletschke B.Review on the use of enzymes for the detection of organochlorine，organophosphate and carbamate pesticides in the environment［J］.Chemosphere，2011，82:291 － 307.

［21］Stenersen J.Chemical pesticides:Mode of action and toxicology［M］.Boca Raton:CRC Press，2004.

［22］Luque de Castro M D，Herrera M C.Enzyme inhibition－based biosensors and biosensing systems:Questionable analytical devices［J］.Biosensors and Bioelectronics，2003，18:279 －294.

［23］Singh R P，Kim Y J，Oh B K，et al.Glutathione－s－transferase based electrochemical biosensor for the detection of captan［J］.E－lectrochemistry Communications，2009，11（1）:181 －185.

［24］張慧君，許學(xué)勤，徐 斐，等.用于農(nóng)藥殘留快速檢測的兩種酶的比較［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，2004，11（32）:1421－1425.

［25］Ivanov A N，Evtugyn G A，Gyurcsányi R E，et al.Comparative investigation of electrochemical cholinesterase biosensors for pesticide determination［J］.Analytica Chimica Acta，2000，404:55 －65.

［26］魏榮卿，沈 斌.殼聚糖載體柔性固定化木瓜蛋白酶［J］.過程工程學(xué)報(bào)，2005，5（2）:183 －187.

［27］楊海朋，陳東成，李春輝.聚環(huán)糊精—碳納米管有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器［J］.化學(xué)傳感器，2010，30（2）:52 －56.

［28］高鹽生，彭少華，沈春平，等.基于自組裝和溶膠—凝膠法固定超氧化物歧化酶的直接電化學(xué)［J］.常熟理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，21:49－52.

［29］Sotiropoulou S，Chaniotakis N A.Tuning the sol－gel microenvironment for acetylcholinesterase encapsulation［J］.Biomaterials，2005，26（33）:6771 －6779.

［30］鄭藝華，王芳芳，徐 斐.微膠囊化提高生物傳感器中固定化雞肝酶操作穩(wěn)定性的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（4）:32－36.

［31］王芳芳，鄭藝華，徐 斐.陽離子交換樹脂吸附交聯(lián)固定雞肝酯酶的實(shí)驗(yàn)研究［J］.離子交換與吸附，2005，21（2）:9 －16.

［32］Zourob M，Ong K G，Zeng K F.A wireless magnetoelastic biosensor for the direct detection of organophosphorus pesticides［J］.Analyst，2007，132（4）:338 －343.

［33］Chough S H，Mulchandani A，Mulchandani P，et al.Organophosphorus hydrolase－based amperometric sensor:Modulation of sensitivity and substrate selectivity［J］.Electroanalysis，2002，14（4）:273－276.

［34］劉 潤，郝玉翠，康天放.基于碳納米管修飾電極檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的生物傳感器［J］.分析試驗(yàn)室，2007，26（9）:9 －12.

［35］Joshi K A，Tang J，Haddon R，et al.A disposable biosensor for organophosphorus nerve agents based on carbon nanotubes modified thick film strip electrode［J］.Electroanalysis，2005，17（1）:54 －58.

［36］Andreescu S，Bucur B，Marty J L.Affinity immobilization of tagged enzymes［M］.Guisan:Humana Press，2006.

［37］康天放，劉 潤，魯理平.再生絲素固定乙酰膽堿酯酶生物傳感器［J］.應(yīng)用化學(xué)，2006，23（10）:1099 －1103.

［38］張淑平，趙月峰，單聯(lián)剛.用于農(nóng)藥殘留檢測的電流型酶傳感器［J］.環(huán)境化學(xué)，2008，27（2）:260 －262.