mir-21的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及在腫瘤中的作用研究進(jìn)展

張經(jīng)波 綜述，汪榮泉 審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400038)

微RNAs(miRNAs)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，約長17～27 nt，在細(xì)胞與組織中特異表達(dá)。miRNAs在各種不同的生物學(xué)進(jìn)程中都發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過靶向結(jié)合基因中與成熟miRNA互補(bǔ)的序列，調(diào)控發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡。miRNAs-靶基因間調(diào)控的異常與一系列癌癥的進(jìn)程密切相關(guān)。超過50％的人類miRNAs基因位于脆性位點(diǎn)或與癌癥相關(guān)的區(qū)域，意味著miRNAs在癌癥的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。一些miRNAs在癌細(xì)胞與組織中異常表達(dá)，并與腫瘤的類型及進(jìn)程相關(guān)。miRNAs的靶基因通常為癌基因或腫瘤抑制基因，通過異常調(diào)控miRNAs-靶基因間關(guān)系及miRNAs自身表達(dá)可直接或間接影響著癌癥的命運(yùn)[1]。mir-21符合了上面所敘述miRNA的所有特點(diǎn)，并作為較早研究的miRNAs之一得到越來越多的關(guān)注。本文就已經(jīng)研究比較詳盡的mir-21有關(guān)基因定位、生成、表達(dá)調(diào)控及與腫瘤的關(guān)系作一綜述。

1 mir-21的基因定位

mir-21在包括哺乳動(dòng)物、鳥類和魚類在內(nèi)的一系列脊椎動(dòng)物中都表現(xiàn)出較強(qiáng)的進(jìn)化保守性。人類中mir-21的基因定位首次被發(fā)現(xiàn)定位于17q23.2，位于TMEM49基因的第10個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。雖然轉(zhuǎn)錄mir-21的啟動(dòng)子位點(diǎn)與蛋白編碼基因TMEM49內(nèi)含子有重疊序列，但是pri-mir-21(mir-21的初始轉(zhuǎn)錄體)卻是被一個(gè)保守的啟動(dòng)子獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的[2]。

2 mir-21的轉(zhuǎn)錄

成熟的mir-21來源于3 433 nt長的pri-mir-21，在pri-mir-21轉(zhuǎn)錄體的+3 394與+3 399間有一個(gè)保守的AAU AAA多聚腺苷酸化信號(hào)，pre-mir-21(mir-21的頸環(huán)前體)則位于+2 445與+2 516間。

Fujita等[2]采用生物信息學(xué)方法首先預(yù)測了mir-21的miRNA的可能啟動(dòng)區(qū)域(miRNA putative promoter regions，miPPRs)，位于的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)上游900 bp位置。隨后，通過實(shí)驗(yàn)在HeLa和HL-60細(xì)胞系中利用引物延伸法，證實(shí)mir-21轉(zhuǎn)錄體起始于miPPR-21中保守的TATA框下游30 bp。與大多數(shù)miRNAs的成熟過程一樣，成熟mir-21的加工過程可以概括如下：首先Pri-miR-21由DNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)轉(zhuǎn)錄，然后，由核內(nèi)的RNAseⅢ酶，Drosha和DGCR8加工形成長72 nt的頸環(huán)前體pre-mir-21，在轉(zhuǎn)運(yùn)酶5(exportin5)的協(xié)助下被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)[3]。到達(dá)胞質(zhì)后，被另外一個(gè)RNAseⅢ酶Dicer，識(shí)別并被切割產(chǎn)生一個(gè)22 nt的miRNA-miRNA復(fù)合體。其中的一條鏈hsa-mir-21可能被降解，而另一條鏈則會(huì)被參入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)形成RNA蛋白復(fù)合體miRNP，通過靶向結(jié)合具有完全或非完全互補(bǔ)序列的imRNAs 3′UTR發(fā)揮調(diào)控作用。

3 mir-21的調(diào)控

目前認(rèn)為mir-21的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平兩個(gè)方面。Fujita等[2]首先對mir-21啟動(dòng)調(diào)控區(qū)的共有序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到幾個(gè)保守的增強(qiáng)子元件，即激活蛋白-1(AP-1)、Ets/PU.1、C/EBP-α，核因子-1(NF-1)、SRF、p53、STAT3。隨后，通過構(gòu)建包含有不同增強(qiáng)子元件的異源熒光報(bào)告質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)AP-1和兩個(gè)Ets/PU.1元件均可以促進(jìn)pri-mir-21的轉(zhuǎn)錄，后者可以增強(qiáng)由前者介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活；NFIB和C/EBP-α結(jié)合到mir-21的啟動(dòng)子則導(dǎo)致mir-21基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平的抑制。Talotta等[4]提出RAS可以介導(dǎo)AP-1激活，并存在由mir-21抑制程序性細(xì)胞死亡4(programmed cell death 4，PDCD4)表達(dá)，PDCD4抑制AP-1表達(dá)，AP-1促進(jìn)pri-mir-21表達(dá)而構(gòu)成的負(fù)負(fù)為正的調(diào)控環(huán)。Loffler等[5]證實(shí)在IL-6刺激的XG-1、INA-6骨髓瘤和HepG2肝癌細(xì)胞中， mir-21的轉(zhuǎn)錄依賴STAT3。IFN誘導(dǎo)的凋亡會(huì)誘發(fā)mir-21形成負(fù)向反饋效應(yīng)，也是通過STAT3[6]。

然而，癌癥中主要miRNAs的異常表達(dá)，大多發(fā)生在成熟miRNAs水平上，而不與pri-miRNA的表達(dá)相關(guān)，暗示mir-21的表達(dá)調(diào)控可能大多發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上[7]。Davis等[8]基于對血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的研究表明，TGF-β和BMP可以誘導(dǎo)mir-21表達(dá)，提示存在調(diào)控mir-21加工的其他機(jī)制。這一過程主要為，TGF-β和BMP信號(hào)系統(tǒng)促使特異SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白受體(SMAD1/5和SMAD2/3)被招募到pri-mir-21并與RNA解螺旋酶p68形成復(fù)合體，從而促使由pri-mir-21到pre-mir-21的快速(30 min內(nèi))加工，再加上隨后的成熟環(huán)節(jié)，調(diào)控了mir-21分子的活化。這一調(diào)控模型在MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞中得到驗(yàn)證。通過致癌性的RAS可以在體內(nèi)或者體外使mir-21表達(dá)上調(diào)[9]。Foxo3a可以從轉(zhuǎn)錄水平抑制mir-21的表達(dá)從而上調(diào)Fasl的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[10]。STAT3通過染色體10上刪失的磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)和CYLD途徑激活mir-21和mir-181b-1，從而使炎癥過度到癌癥[11]。另外，mir-21通過直接靶向作用于3′非翻譯區(qū)域來抑制RHOB的表達(dá)。而RHOB具有腫瘤抑制作用[12]。另有研究表明，Mir-21可以由NF-kappaB 直接調(diào)節(jié)，而細(xì)胞增殖是由EP2/4 receptors介導(dǎo)的[13]。NF-kappaB 結(jié)合位點(diǎn)位于mir-21基因轉(zhuǎn)錄原件上，而且尼古丁對這種結(jié)合有增強(qiáng)作用。

兩種調(diào)控方式也可能發(fā)生在同一個(gè)系統(tǒng)中。如，在乳腺癌及結(jié)腸癌中，應(yīng)答缺氧時(shí)mir-21被誘導(dǎo)高表達(dá)，同時(shí)在pri-mir-21的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)中發(fā)現(xiàn)存在缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)結(jié)合位點(diǎn)；此外，在不依賴HIF-1的情況下，通過AP-1轉(zhuǎn)錄或被TGF-β信號(hào)途徑刺激也可誘導(dǎo)mir-21成熟[14]。

4 mir-21與腫瘤

在星形細(xì)胞瘤[15]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌[16]、結(jié)直腸癌[17]、肝癌[18]、乳腺癌[19]、肺癌[20]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[21]等癌癥中mir-21都特異性高表達(dá)。在人類單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞的過程中，mir-21表達(dá)也增高[22]。從功能方面看，甄別癌癥早期起始與演進(jìn)的分型是困難的(特別是單個(gè)細(xì)胞或少許細(xì)胞階段)。但是，基于miRNA表達(dá)譜的分析給上述問題的解決帶來了希望。

此外，對于miR-21與致瘤性轉(zhuǎn)化間的因果關(guān)系的功能研究報(bào)道較少。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)mir-21通過調(diào)控不同的抑癌基因介導(dǎo)了多種腫瘤的發(fā)生，暗示miR-21的致癌活性。

Gabriely等[23]證實(shí)mir-21可以調(diào)控與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡相關(guān)的多個(gè)基因，包括RECK、TIMP3和腫瘤抑制子及阻礙基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的因子。mir-21通過下調(diào)MMPs的抑制子從而活化MMPs促使細(xì)胞侵襲增加腫瘤的惡性程度。乳腺癌細(xì)胞MCF-7中mir-21可能通過調(diào)控Bcl-2等相關(guān)基因而調(diào)節(jié)腫瘤生成，因?yàn)橐种苖iR-21可以導(dǎo)致體外細(xì)胞生長減緩和體內(nèi)裸鼠模型中腫瘤生長的抑制[24]。轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中mir-21可以通過抑制腫瘤抑制基因原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)、PDCD4、maspin而介導(dǎo)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。肝細(xì)胞中抑制miR-21，會(huì)提高PTEN的表達(dá)，并降低腫瘤細(xì)胞增殖，遷移與侵襲。反之，提高miR-21的表達(dá)則效果相反[25]。有實(shí)驗(yàn)表明，脂多糖刺激后，mir-21增高而PDCD4降低。結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，miR-21與腫瘤抑制蛋白PDCD4呈負(fù)相關(guān)。抑制miR-21可以導(dǎo)致PDCD4蛋白水平的提高并降低侵襲力，過表達(dá) miR-21則可以提高侵襲力及遷移性。在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞，mir-21可以由維生素A誘導(dǎo)。該研究還找到了3個(gè)新的mir21靶點(diǎn)：炎癥前細(xì)胞因子 IL1B、黏附分子 ICAM-1和PLAT、組織型纖溶酶原激活物。mir-21在對化療藥物抵抗的白血病細(xì)胞系K562中表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能包括PI3K/Akt 通路及PREN蛋白表達(dá)的改變。mir-21會(huì)下調(diào)腫瘤抑制基因P12(CDK2AP1)，從而促進(jìn)增殖和浸潤。在非小細(xì)胞肺癌中，mir-21抑制腫瘤抑制基因PREN，并促進(jìn)腫瘤的生長和浸潤。然而，在一篇對前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，mir-21不足以影響細(xì)胞的增殖和侵襲能力，對PTEN和PDCD4的影響也有限。

在其他多種腫瘤模型中，mir-21的靶基因已經(jīng)或正在陸續(xù)被鑒定。miR-21的異常表達(dá)調(diào)控了相應(yīng)的腫瘤抑制基因，從而影響著腫瘤的起始與演進(jìn)，因此，miR-21在某種意義上可以被稱之為癌相關(guān)miRNA。

很多研究通過抑制mir-21，以嘗試對腫瘤的治療作用。有研究顯示，抑制mir-21對抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡效果明顯，且會(huì)激活caspase 9和caspase 3。mir-21在喉鱗狀細(xì)胞癌高表達(dá)，用反義寡核苷酸抑制mir-21后RAS表達(dá)下降，其增殖和侵襲都受到抑制。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制mir-21不能阻止神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。下調(diào)mir-21會(huì)抑制EGFR 通路并抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖，雖然PTEN存在不同的狀態(tài)，但該過程與PTEN的狀態(tài)無關(guān)。小的互補(bǔ)miRNA序列可以抑制miRNA的功能，可能成為一個(gè)潛在的治療手段，但是mir-21的遺傳缺失卻不具有這樣的作用。mir-21敲除也可能作為一種新的白血病治療手段。也有研究者試圖將其作為一個(gè)新的神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向治療的靶標(biāo)。

5 展 望

在癌癥中對于miRNAs重要角色的界定已經(jīng)打開了癌癥探索的新領(lǐng)域，此外許多miRNAs也已被鑒定為致瘤性轉(zhuǎn)化、侵襲與遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，而mir-21作為其中之一在眾多癌癥中發(fā)生異常表達(dá)也已通過不同實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。雖然其中的原因已經(jīng)有了很多解釋，包括轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，但是相關(guān)佐證仍需進(jìn)一步完善。探索miRNA的功能非常復(fù)雜，例如：mir-21通過作用于PDCD4抗凋亡，從而保護(hù)心肌缺血。對于miRNAs表達(dá)的組織特異性以及不同miRNAs在一個(gè)特殊靶標(biāo)上的聯(lián)合作用應(yīng)同時(shí)予以考慮。因此，在正常細(xì)胞、組織和個(gè)體中mir-21是如何被調(diào)控的以及mir-21又如何調(diào)控下游靶基因等問題，將成為下一步通過人為干預(yù)mir-21表達(dá)而達(dá)到癌癥治療等相關(guān)設(shè)計(jì)時(shí)所需要考慮的重點(diǎn)。

盡管如此，針對mir-21等miRNAs的研究，已經(jīng)更加證明了“RNA信號(hào)通路”的重要性，并且其與更為保守的蛋白信號(hào)通路之間存在相關(guān)性。這種對于正常與致瘤性細(xì)胞侵襲的系統(tǒng)性基因網(wǎng)絡(luò)理解的深入探索，定將帶給癌癥診斷與治療提供新途徑。

[1]Zhu S,Wu H,Wu F，et al.MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis[J].Cell Res,2008,18(3):350-359.

[2]Fujita S,Ito T,Mizutani T,et al.miR-21 Gene expression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism[J].J Mol Biol,2008,378(3):492-504.

[3]Lee Y,Han J,Yeom KH,et al.Drosha in primary microRNA processing[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2006,71(8):51-57.

[4]Talotta F,Cimmino A,Matarazzo MR,et al.An autoregulatory loop mediated by miR-21 and PDCD4 controls the AP-1 activity in RAS transformation[J].Oncogene,2009,28(1):73-84.

[5]Loffler D,Brocke-Heidrich K,Pfeifer G,et al.Interleukin-6 dependent survival of multiple myeloma cells involves the Stat3-mediated induction of microRNA-21 through a highly conserved enhancer[J].Blood,2007,110(4):1330-1333.

[6]Yang CH,Yue J,Fan M,et al.IFN induces miR-21 through a signal transducer and activator of transcription 3-dependent pathway as a suppressive negative feedback on IFN-induced apoptosis[J].Cancer Res,2010,70(20):8108-8116.

[7]Thomson JM,Newman M,Parker JS,et al.Extensive post-transcriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer[J].Genes Dev,2006,20(16):2202-2207.

[8]Davis BN,Hilyard AC,Lagna G,et al.SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation[J].Nature,2008,454(7200):56-61.

[9]Frezzetti D,De Menna M,Zoppoli P,et al.Upregulation of miR-21 by Ras in vivo and its role in tumor growth[J].Oncogene,2011,30(3):275-286.

[10]Wang K,Li PF.Foxo3a regulates apoptosis by negatively targeting miR-21[J].J Biol Chem,2010,285(22):16958-16966.

[11]Iliopoulos D,Jaeger SA,Hirsch HA,et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer[J].Mol Cell,2010,39(4):493-506.

[12]ConnollyEC,VanDoorslaerK,RoglerLE,etal.OverexpressionofmiR-21promotesaninvitro

metastatic phenotype by targeting the tumor suppressor RHOB[J].Mol Cancer Res,2010,8(5):691-700.

[13]Shin VY,Jin H,Ng EK,et al.NF-kappaB targets miR-16 and miR-21 in gastric cancer: involvement of prostaglandin E receptors[J].Carcinogenesis,2011,32(2):240-245.

[14]Kulshreshtha R,Ferracin M,Wojcik SE,et al.A microRNA signature of hypoxia[J].Mol Cell Biol,2007,27(5):1859-1867.

[15]Zhi F,Chen X,Wang S,et al.The use of hsa-miR-21,hsa-miR-181b and hsa-miR-106a as prognostic indicators of astrocytoma[J].Eur J Cancer,2010,46(9):1640-1649.

[16]Ribas J,Lupold SE.The transcriptional regulation of miR-21,its multiple transcripts,and their implication in prostate cancer[J].Cell Cycle,2010,9(5):923-929.

[17]Kulda V,Pesta M,Topolcan O,et al.Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases[J].Cancer Genet Cytogenet,2010,200(2):154-160.

[18]Xu J,Wu C,Che X,et al.Circulating microRNAs,miR-21,miR-122,and miR-223,in patients with hepatocellular carcinoma or chronic hepatitis[J].Mol Carcinog,2011,50(2):136-142.

[19]Mei M,Ren Y,Zhou X,et al.Downregulation of miR-21 enhances chemotherapeutic effect of taxol in breast carcinoma cells[J].Technol Cancer Res Treat,2010,9(1):77-86.

[20]Gao W,Shen H,Liu L,et al.MiR-21 overexpression in human primary squamous cell lung carcinoma is associated with poor patient prognosis[J].J Cancer Res Clin Oncol,2011,137(4):557-566.

[21]Rossi S,Shimizu M,Barbarotto E,et al.microRNA fingerprinting of CLL patients with chromosome 17p deletion identify a miR-21 score that stratifies early survival[J].Blood,2010,116(6):945-952.

[22]Cekaite L,Clancy T,Sioud M.Increased miR-21 expression during human monocyte differentiation into DCs[J].Front Biosci,2010,2(5):818-828.

[23]Gabriely G,Wurdinger T,Kesari S,et al.MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators[J].Mol Cell Biol,2008,28(17):5369-5380.

[24]Si ML,Zhu S,Wu H,et al.miR-21-mediated tumor growth[J].Oncogene,2007,26(19):2799-2803.

[25]Meng F,Henson R,Wehbe-Janek H，et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J].Gastroenterology,2007,133(2):647-658.