椎間盤退行性變的生物學(xué)治療進(jìn)展＊

韓小偉綜述，馮 剛審校

（1.川北醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川南充637000；2.四川省南充市中心醫(yī)院／川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 637000）

椎間盤退行性變可誘發(fā)脊柱退行性改變、椎間盤髓核突出、椎管狹窄等疾病，是引起下腰痛的主要原因，因其具有高發(fā)病率和高致殘率的特點(diǎn)，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前的治療措施主要包括髓核摘除、椎管減壓及退變脊柱節(jié)段融合等，但只能在短期內(nèi)緩解臨床癥狀，其遠(yuǎn)期療效并不顯著，且存在并發(fā)癥多的缺點(diǎn)[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞數(shù)量減少、壓力損傷終板的微骨折、細(xì)胞外基質(zhì)降解增加、炎癥因子的異常表達(dá)等均可導(dǎo)致椎間盤的主要成分代謝失衡，從而引發(fā)椎間盤退行性變的發(fā)生、發(fā)展。研究人員以此為基礎(chǔ)，針對退行性變的不同階段，利用基因工程、細(xì)胞工程、組織工程手段來恢復(fù)退行性變椎間盤細(xì)胞數(shù)量或重建椎間盤解剖結(jié)構(gòu)和生理功能，從根本上為治療椎間盤退行性變提供了有效策略。

1 椎間盤的結(jié)構(gòu)功能及退變特點(diǎn)

椎間盤屬于免疫豁免、完全封閉、無血管的組織結(jié)構(gòu)，由中央的髓核（NP）、外周的纖維環(huán)（AF）及上下軟骨終板（CEP）3部分構(gòu)成。纖維環(huán)呈同心環(huán)狀排列，分外層的成纖維細(xì)胞層和內(nèi)層的類軟骨細(xì)胞層；髓核細(xì)胞生長在髓核凝膠狀基質(zhì)中，主要含脊索細(xì)胞和類軟骨樣細(xì)胞，細(xì)胞含量較少，但相互之間聯(lián)系緊密。髓核細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其主要作用是保持正常椎間盤的含水量，保證細(xì)胞正常代謝及均勻分布椎間盤應(yīng)力，從而維持椎間盤一定的形態(tài)和靜水壓，有效對抗自身體質(zhì)量和肌肉運(yùn)動產(chǎn)生的應(yīng)力，因此髓核是行使椎間盤功能的關(guān)鍵部位。

椎間盤由于完全封閉，其營養(yǎng)代謝途徑主要通過以軟骨終板通路的滲透作用出入椎間盤，此過程受到血管因素、軟骨終板、基質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞因素和機(jī)械因素等影響[2]。一旦滲透功能降低，其營養(yǎng)物和代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)將受阻，加之局部炎癥因子以及特定基因表達(dá)異常等，促使椎間盤細(xì)胞生物活性降低，細(xì)胞外基質(zhì)（蛋白聚糖、膠原蛋白等）降解增加，從而引起基質(zhì)代謝失衡，細(xì)胞凋亡加快、間盤水分減少、高度降低，最終導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)發(fā)生改變。

2 基因工程干預(yù)早期椎間盤退行性變

基因治療是通過把一段特定的核酸序列（目的基因）以一定技術(shù)或載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，以改變細(xì)胞核酸成分使其表達(dá)特定的細(xì)胞因子，從而達(dá)到治療或者預(yù)防疾病的目的。通過改變細(xì)胞遺傳學(xué)性狀，使其持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)基質(zhì)主要成分，不僅影響靶細(xì)胞自身的代謝，還影響周圍細(xì)胞的代謝。

椎間盤退行性變的早期，細(xì)胞輕度受損，基質(zhì)分泌能力有所下降。因此早期調(diào)控特定細(xì)胞因子和抑制炎癥因子的表達(dá)，可增加蛋白聚糖和膠原蛋白的合成，維持椎間盤的正常形態(tài)及功能或減緩椎間盤退。然而直接將細(xì)胞因子和炎癥因子拮抗劑注入椎間盤，往往作用短暫而且價格昂貴，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為解決細(xì)胞因子和炎癥因子拮抗劑持續(xù)作用于椎間盤帶來了便捷之道。

2.1 目的基因的選擇 能夠促使靶細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)所需細(xì)胞因子的目的基因主要分以下兩類，一類為促進(jìn)細(xì)胞合成代謝途徑的轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）、胰島素樣生長因子（IGF－1）、骨形態(tài)生成蛋白（BMPs）、骨礦化蛋白1（LMP－1）、SOX9基因等；另一類為阻斷細(xì)胞外基質(zhì)降解途徑的金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP－1）、白細(xì)胞介素1受體抗體（IL－1Ra）基因等。

Le Maitre等[3]將IL－1與IL－1Ra加入到體外培養(yǎng)的人髓核細(xì)胞中，證實(shí)IL－1Ra能抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增加蛋白聚糖的合成。而IL－1則增加基質(zhì)蛋白酶3與13的水平，促進(jìn)蛋白多糖的分解。在研究單個目的基因的作用水平同時，也有研究人員通過進(jìn)行多基因聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)，來觀察細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。Kim和Ellman[4]用BMP－7和IGF－1共同作用于牛髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照BMP－7或者IGF－1的單一轉(zhuǎn)染，聯(lián)合轉(zhuǎn)染的蛋白表達(dá)量增加更為明顯。但是多種基因的聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)是否真正有效，研究人員之間也存在不同的觀點(diǎn)，作者認(rèn)為這可能與目的基因選擇和轉(zhuǎn)入后基因之間的相互作用有一定關(guān)系。

2.2 基因治療的載體 應(yīng)用基因療法來治療椎間盤退行性變必須要有一個基因傳遞載體，能在體內(nèi)或體外把目的基因?qū)氚屑?xì)胞?，F(xiàn)有的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。非病毒載體能避免轉(zhuǎn)染載體的播散和降低宿主對載體的免疫反應(yīng)，但是它仍受到轉(zhuǎn)染率不高、基因表達(dá)時間短的困擾。而病毒由于能夠侵入細(xì)胞并影響轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此最常被用來做為基因傳遞載體。

病毒載體可以分為兩類，一類是可以把基因整合到宿主染色體內(nèi)而增加其表達(dá)時間的載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV，包括慢病毒載體）；另一類則不把基因整合入宿主細(xì)胞的染色體，如腺病毒（AV）、腺相關(guān)病毒（AAV）。

以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV－1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的慢病毒載體，具有能感染各時相的細(xì)胞，并可攜帶較大的基因片段、延長目的基因表達(dá)時間等優(yōu)勢，是近年來基因工程運(yùn)用較多的病毒載體。Miyazaki等[5]把BMP－2基因整合到慢病毒，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果細(xì)胞貼附生長的膠原三維支架逐漸消失，注入部位的相鄰橫突間彼此形成骨連接。

腺相關(guān)病毒屬微小病毒科家族成員，其復(fù)制依賴于其他輔助病毒，如AV、痘苗病毒等。通過對AV和AAV這兩種載體對椎間盤基因治療的安全性作了對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺病毒轉(zhuǎn)染組大多出現(xiàn)了明顯的臨床、組織學(xué)及病理學(xué)改變，而腺相關(guān)病毒組則未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[6]。

3 細(xì)胞移植治療中期椎間盤退行性變

椎間盤退行性變中期，細(xì)胞進(jìn)一步受損，基質(zhì)分泌能力嚴(yán)重下降，基質(zhì)的降解加快，但病變?nèi)灾幌拗朴谒韬私M織中。此階段單純基因治療并不能有效地干預(yù)退變的進(jìn)展，相比之下細(xì)胞移植則不僅能補(bǔ)充椎間盤細(xì)胞數(shù)量，而且還可以聯(lián)合基因工程以提高細(xì)胞分泌活性，增加細(xì)胞外基質(zhì)含量。因此，細(xì)胞移植是延緩中期椎間盤退變的理想方法?，F(xiàn)有的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系為研究者提供了較多類型移植所需的種子細(xì)胞，但細(xì)胞來源、分化表型、增殖能力、科學(xué)倫理等因素又極大地限制了研究者的選擇。

3.1 自體或異體椎間盤細(xì)胞移植 椎間盤細(xì)胞包括脊索細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞。脊索細(xì)胞可以促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖分化，對維持髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞外基質(zhì)含量起重要作用；正常髓核細(xì)胞能合成蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，是構(gòu)建椎間盤組織工程的理想的種子細(xì)胞。Nomura等[7]將兔同種異體的完整髓核和髓核細(xì)胞移入吸出髓核導(dǎo)致的椎間盤退行性變模型中，16周后進(jìn)行組織學(xué)觀察和免疫組化檢測，結(jié)果顯示，移植完整髓核的椎間盤退行性變最輕，移植髓核細(xì)胞的椎間盤次之，未治療的椎間盤退變最嚴(yán)重，每組通過CD4和CD5抗體檢查T和B淋巴細(xì)胞反應(yīng)均未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。針對體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞增殖能力較低且易發(fā)生退變，Lwashina等[8]成功建立出人髓核細(xì)胞系（HNPSV），并將其植入退變椎間盤，免疫組化分析和形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)移植組椎間盤髓核與纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)明顯增高。

3.2 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 主要來源于骨髓、脂肪、臍帶，屬于成體干細(xì)胞的分支，現(xiàn)有的研究表明MSCs在椎間盤基質(zhì)微環(huán)境、生物活性物質(zhì)或椎間盤細(xì)胞等共培養(yǎng)條件下均具有向髓核細(xì)胞分化的潛能。Yang等[9]將MSCs植入鼠椎間盤退變模型，證實(shí)MSCs可以向髓核細(xì)胞分化，誘導(dǎo)脊索細(xì)胞數(shù)量增加，提高蛋白聚糖基因的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)在髓核部位的聚積。Gaetani等[10]將人脂肪干細(xì)胞和髓核細(xì)胞在體外藻酸鹽三維培養(yǎng)基中共培養(yǎng)用透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，免疫熒光法測細(xì)胞外基質(zhì)；結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞表達(dá)出髓核細(xì)胞樣生物活性，產(chǎn)生大量的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，從而能在體外構(gòu)建出髓核組織。

3.3 誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs） iPSCs在形態(tài)學(xué)、分子學(xué)以及分化潛能等方面與胚胎干細(xì)胞極為相似，彌補(bǔ)了胚胎干細(xì)胞倫理學(xué)爭論和異體排異反應(yīng)的缺陷，以及解決了間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化能力有限的難題。因其具有胚胎干細(xì)胞樣特性，而倍受人們關(guān)注，已有學(xué)者成功地將iPSCs誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞，并具有相應(yīng)功能特性和表達(dá)特異性標(biāo)記[11－12]。

有研究認(rèn)為軟骨細(xì)胞是細(xì)胞移植的治療椎間盤退變的最佳種子細(xì)胞。Kuh等[13]體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞，用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（rhBMP－2）添加前后做比較，結(jié)果證實(shí)軟骨細(xì)胞生成的蛋白聚糖量最多。然而軟骨細(xì)胞含量稀少，且增殖能力有限，限制了其在研究中的運(yùn)用。

4 組織工程重建椎間盤

椎間盤退行性變后期，盤內(nèi)細(xì)胞含量極少，分泌功能喪失，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，纖維環(huán)破裂、髓核突出，壓迫脊髓、神經(jīng)根等組織導(dǎo)致各種嚴(yán)重的臨床癥狀。在此階段，基因工程和細(xì)胞工程手段均難以恢復(fù)椎間盤結(jié)構(gòu)及其生理功能，因此運(yùn)用組織工程技術(shù)重建出具有仿生學(xué)性能的椎間盤是我們治療退變后期的關(guān)鍵突破口。

目前，組織工程椎間盤的研究主要集中在種子細(xì)胞、支架材料、生物活性因子3個方面。除上文提及的種子細(xì)胞外，常用的組織工程支架材料可分為天然生物材料、人工合成材料以及復(fù)合材料。天然生物材料包括膠原、藻酸鹽、糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs）[14]、殼聚糖凝膠[15]等；人工 合成材料主要有多聚左旋乳酸（Poly－L－lactic acid，PLLA）[16]、聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）、聚已酸內(nèi)酯三元醇等；復(fù)合材料則是由兩種或兩種以上的不同材料優(yōu)化組合而成，是椎間盤組織工程的重點(diǎn)研究方向。

4.1 髓核組織工程支架材料研究 去端肽膠原為膠原上抗原決定簇去掉后的一種變性膠原，經(jīng)處理后免疫排斥性進(jìn)一步得到了降低了，且在4℃～10℃時呈半液態(tài)，在37℃時呈固態(tài)，可以按需要塑形。Halloran等[17]將牛尾骨椎間盤髓核細(xì)胞接種在去端肽Ⅱ型膠原支架上培養(yǎng)，結(jié)果表明該支架能促進(jìn)細(xì)胞生長并穩(wěn)定的維持細(xì)胞表型。Mauth等[18]將纖維蛋白水凝膠與聚氨酯復(fù)合以改善支架力學(xué)性能和降解速率，提高細(xì)胞粘附性能；他們將髓核細(xì)胞接種于纖維蛋白凝膠－聚氨酯支架進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞的粘附、增殖能力、表型特性得到維持；生化分析進(jìn)一步表明細(xì)胞DNA含量增加，膠原、GAGs等細(xì)胞外基質(zhì)合成增多。

4.2 纖維環(huán)組織工程支架材料研究 Shao等[19]將犬纖維環(huán)細(xì)胞接種于藻酸鹽復(fù)合支架，掃描電鏡顯示纖維環(huán)細(xì)胞生長增殖情況良好、細(xì)胞外基質(zhì)豐富；同時復(fù)合支架能緩慢降解，降解產(chǎn)物無細(xì)胞毒性。Wan等[20]構(gòu)建的蘋果酸／聚酯聚合物POM支架，具有更好的機(jī)械強(qiáng)度和伸縮性，種植在上面的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞生長良好，同時有Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生；此外，該研究組成員還成功構(gòu)建出一種雙相三維彈性支架材料，內(nèi)相支架由同心狀的聚己酸內(nèi)酯蘋果酸三醇構(gòu)成，其外相支架由環(huán)狀脫鈣骨基質(zhì)明膠（BMG）構(gòu)成，分別模擬內(nèi)外層纖維環(huán)，物理測試結(jié)果顯示其拉伸應(yīng)力接近動物椎間盤纖維環(huán)的生理水平[21]。

4.3 軟骨終板組織工程支架材料研究 軟骨終板是供應(yīng)椎間盤營養(yǎng)的平臺，其發(fā)生硬化、鈣化及增厚往往是誘發(fā)椎間盤退變的始動因素，然而軟骨終板是一薄層軟骨，構(gòu)建其完整的支架材料難度很大。Hamilton等[22]在多孔聚磷酸鈣（CPP）表面種植軟骨終板細(xì)胞，培養(yǎng)至8周，通過組織學(xué)、形態(tài)學(xué)、力學(xué)性能等分析，證實(shí)在CPP表面形成了軟骨終板樣組織。Wang和Campbell[23]以聚乙烯醇冷凝膠（PVA－C）模擬天然椎間盤軟組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PVA－C具有良好的生物力學(xué)特性和生物相容性，為構(gòu)建軟骨終板提供了有效的材料選擇。

5 問題與展望

雖然應(yīng)用生物學(xué)手段治療椎間盤退變的研究結(jié)果令人興奮，但是要最終從實(shí)驗(yàn)向臨床治療過渡還需解決諸多問題。（1）目的基因的導(dǎo)入效率低下，通常需要轉(zhuǎn)染回輸多次才能成功，既損傷了靶細(xì)胞的增殖活性又增加了多基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢測難度。（2）病毒載體插入或整合到染色體的位置是隨機(jī)的，大劑量病毒載體導(dǎo)致的免疫反應(yīng)以及靶細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險難以排除。（3）現(xiàn)有椎間盤退變的模型大多是通過人為因素制造，和椎間盤本身的退變機(jī)制存在一定差異。（4）如果不能解決椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)，即使前期的工作獲得成功也是沒有任何意義的。（5）在體外培養(yǎng)出的種子細(xì)胞團(tuán)，最終需要植入體內(nèi)才能完成它的功能，而目前的研究多在于體外培養(yǎng)和動物實(shí)驗(yàn)，雖然能夠表現(xiàn)出一定的生物修復(fù)可能性，但植入人體內(nèi)是否有效發(fā)揮作用是一個難以預(yù)測的問題。（6）植入的載體支架其仿生學(xué)性能未曾有理想的突破，有待進(jìn)一步解決。（7）在椎間盤退變的病理分級，及其各分級干預(yù)的方式，尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

未來研究將會集中在深入了解椎間盤退變的生物學(xué)機(jī)制、種子細(xì)胞的誘導(dǎo)培育、仿生支架的構(gòu)建及其多個工程手段聯(lián)合干預(yù)等方面。相信隨著科研工作者的不懈努力，上述問題將會逐一解決，并最終應(yīng)用于臨床。

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