大豆纖維多糖降解技術(shù)研究進展

姚 磊，王振宇，趙海田，程翠林，富校軼，孫樹坤

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；3.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

豆渣是大豆經(jīng)提取油脂、蛋白質(zhì)后的副產(chǎn)物（約占大豆質(zhì)量的40%），每年產(chǎn)量約600萬t，一般都作為飼料或廢棄物處理，只有少部分被加工利用，經(jīng)濟效益較低，資源浪費極大，同時也容易造成環(huán)境污染[1]。豆渣中含有豐富的不溶性纖維多糖類物質(zhì)（約70%），通過微生物、酶法、氧化、物理降解等方法對豆渣進行降解可以得到不同分子質(zhì)量范圍的大豆纖維降解多糖（以下簡稱大豆多糖）、寡糖以及葡萄糖等單糖類物質(zhì)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等多種生物活性和保健功能[2-4]，可作為各種藥物和保健品的有效成分。然而，由于相對分子質(zhì)量大，多糖大多存在溶解性差的缺點，嚴重影響了其生物利用率。對纖維多糖的適度降解，降低其相對分子質(zhì)量，可大大增進其溶解性，更利于其生物活性的釋放[4-6]。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，不溶性大豆纖維多糖，經(jīng)酶解后得到的大豆纖維降解多糖具有良好的清除自由基及抗輻射功能[7]。因此，如何快速有效的降解纖維多糖，并使其保持或增進其良好的生物活性的研究，具有重要的意義。本文對近年來國內(nèi)外大豆纖維多糖降解技術(shù)的研究進展作一綜述。

1 大豆纖維多糖降解技術(shù)研究

1.1 化學(xué)法

化學(xué)法降解主要有酸法、堿法及氧化法。

1.1.1 酸法處理

酸水解法是最早被研究也是研究得最深入的。應(yīng)用最多的為硫酸和鹽酸。另外，硝酸或醋酸亦有應(yīng)用。其中效果最好、應(yīng)用最廣泛的是稀硫酸[8]。酸法水解纖維素的機理如下：酸在水中解離出氫離子，水合氫離子與纖維素鏈上的β-1，4-糖苷鍵接觸，β-1，4-糖苷鍵上的氧接受一個氫離子（H+），使氧鍵斷裂，并與水反應(yīng)生成羥基同時放出H+，H+可再次催化水解反應(yīng)[9-10]。酸法處理的木質(zhì)纖維素原料，在半纖維素水解的同時，可破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使原料結(jié)構(gòu)變疏松，從而提高了纖維素的水解率。酸法水解多糖的缺點是，反應(yīng)時間較長，腐蝕金屬設(shè)備，處理后產(chǎn)生發(fā)酵抑制物，在有后續(xù)微生物發(fā)酵或酶法工藝處理的情況下，必須在發(fā)酵前將酸中和。熊杰等采用有機酸水溶液提取大豆渣中水溶性大豆多糖，得到最佳工藝條件：溫度110℃，提取時間1.5 h，用酒石酸調(diào)節(jié)pH 3.8，水溶性大豆多糖得率達27.65%[11]。適當條件下，酸水解法可將多糖有效水解成單糖，在單糖組分分析中有廣泛的應(yīng)用[12-13]。Hoebler等研究了二步酸水解法，第一步，于72%硫酸中，25℃水解30 min，第二步，于2 mol·L-1硫酸中，煮沸120 min，利用此法對多種植物纖維多糖進行單糖組分分析，取得了較好的效果[14]。

1.1.2 堿法處理

堿性降解與上述酸性水解相似，即多糖在適當pH、溫度和時間下糖苷鍵斷裂，聚合度下降。堿性降解包括堿性水解反應(yīng)和剝皮反應(yīng)兩種類型。在堿性溶液中，很溫和的條件下，纖維素和半纖維素會從還原性末端發(fā)生β-氧烷基消除，逐個糖基降解，即發(fā)生剝皮反應(yīng)直到產(chǎn)生末端基轉(zhuǎn)變?yōu)槠兲撬峄姆€(wěn)定反應(yīng)為止。條件強烈時，發(fā)生水解反應(yīng)，使糖苷鍵斷裂，暴露更多還原端，可加速剝皮反應(yīng)的發(fā)生。由于堿性降解產(chǎn)物異變糖酸鈉鹽會制約不溶解性纖維向可溶性多糖的轉(zhuǎn)變，因此堿解可溶性多糖得率較酸解差些[15]。馬殿君等以豆渣為原料[16]，在堿性條件下脫除蛋白，所得豆渣用1∶4的30%氫氧化鈉溶液，在45℃下反應(yīng)90 min，以干豆渣計算，水溶性大豆多糖提取率為48%。孟岳成等在堿性條件下提取可溶性大豆多糖的工藝[17]，通過試驗得出最佳的提取條件為料液比1∶20，pH 11.0，提取溫度120℃，反應(yīng)時間2.0 h，大豆多糖平均得率為16.24%。

1.1.3 氧化法

氧化法就是利用過氧化氫、臭氧或氧氣等氧化劑，通過氧化反應(yīng)，切斷糖苷鍵，達到多糖降解的目的。其中，研究最多，操作最簡便的是過氧化氫降解法。過氧化氫降解多糖的機理目前還不清楚。比較公認的降解機理是：過氧化氫在反應(yīng)體系中會產(chǎn)生羥自由基（·OH），羥自由基隨機地進攻糖鏈上的任意一個糖殘基的C-1位的氫，發(fā)生分子內(nèi)的重排，斷裂1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生分子質(zhì)量較小的糖[18]。氧化法降解隨機性較大，因此，降解所得產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍較寬，包括一系列分子質(zhì)量大小不一的寡糖及單糖。韓玉紅等利用過氧化氫對海洋硫酸多糖降解進行了研究，過氧化氫濃度為3%，原料用量為2%，反應(yīng)時間為3 h，海洋硫酸多糖916平均分子質(zhì)量由8 000降到2 237。用這種方法降解多糖，方法簡便易行，試劑廉價易得，選用過氧化氫作為氧化劑效率高，無殘毒，是較理想的一種降解方法[19]。王靜等用過氧化氫水解分子質(zhì)量40萬的殼聚糖，80℃下，水解3 h，殼聚糖完全水溶，產(chǎn)物殼寡糖分子質(zhì)量降到609[20]。

1.2 物理法

1.2.1 超聲波法

超聲波降解大分子物質(zhì)主要是自由基氧化和機械斷鍵兩種作用的共同結(jié)果。超聲波狀態(tài)下，大分子物質(zhì)產(chǎn)生激烈機械運動，隨著波動的高速振動及剪切力的作用而降解。超聲波產(chǎn)生空穴效應(yīng)，在空穴破碎時，會產(chǎn)生局部性的高壓和劇烈的溫度變化，為自由基產(chǎn)生提供能量。自由基則可攻擊分子鍵，造成氧化斷裂，是大分子物質(zhì)降解[21]。超聲波對多糖的降解具有節(jié)省能源，時間少，操作程序簡單，有機溶劑用量少和污染小等優(yōu)點，但是該法突出的缺點是收率太低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，要實現(xiàn)工業(yè)化還有待于進一步的研究。陳紅等研究超聲波輔助提取水溶性大豆多糖[22]，確定最佳工藝參數(shù)為提取pH 4.5，溫度90 ℃，液料比 20∶1（mL·g-1），超聲波功率200 W，提取時間40 min，大豆多糖得率為8.82%。李宏睿等采用超聲波輔助提取水溶性大豆多糖，最優(yōu)工藝參數(shù)：超聲波功率150 W，超聲波處理20 min，提取時間4 h，溫度為80℃，料液比為1∶40，大豆多糖得率為3.542%[23]。

1.2.2 輻射法

聚合物的輻射降解是聚合物在電離作用下主鏈斷裂、分子質(zhì)量降低，結(jié)果使聚合物在溶劑中的溶解度增加，而相應(yīng)的熱穩(wěn)定性、機械性能降低。利用高能離子輻射（如離子束、γ射線）對纖維素原料進行處理，獲得有所改變的纖維素聚合度和增加纖維素的反應(yīng)可及度。輻射降解是無須添加物的固相反應(yīng)，成本低，反應(yīng)易控，無污染，具有廣闊的發(fā)展前景。但它的實施必須建立在有電離輻射設(shè)備，且輻射強度相當高的前提之下，這種方法在實際生產(chǎn)應(yīng)用上有一定局限性[24]。Yang等通過60Co預(yù)處理小麥秸稈，以不同的劑量進行輻射，輻射能夠明顯破壞小麥秸稈的結(jié)構(gòu)，使酶水解的糖產(chǎn)量明顯增加，在500 kGy達到最大值13.40%[25]。李治等利用γ射線輻射降解殼聚糖，當輻射劑量達到250 kGy時，大氣環(huán)境下殼聚糖的分子質(zhì)量從27.4萬下降到2.4萬，降解反應(yīng)主要由殼聚糖分子鏈上的C1-O-C4鍵斷裂引起[26]。

1.2.3 等離子體降解

高壓脈沖放電是常壓下產(chǎn)生等離子體的主要方法。等離子降解法包括物理作用下有機物的直接降解和化學(xué)作用下活性物質(zhì)對有機物的高級氧化降解[27-28]。研究認為，等離子體兼具高溫?zé)峤到?、高能電子輻射、臭氧氧化、紫外光降解、光化學(xué)氧化、超臨界水氧化、液電空化降解、高能電子、自由基、激發(fā)態(tài)分子等多種作用的綜合效應(yīng)[29-30]。等離子體作用產(chǎn)生的這些活性物質(zhì)及其高能電子轟擊纖維素或多糖中C-C鍵及不飽和鍵，發(fā)生斷鍵和開環(huán)等一系列反應(yīng)，可使大分子物質(zhì)變成小分子，達到降解的效果。馬鳳鳴等采用脈沖放電等離子體提取黑木耳多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：脈沖放電電壓為40.3 kV，液料比為1∶40.5，處理時間為4.1 min。在此條件下多糖得率達8.80%[31]。

1.3 生物技術(shù)法

1.3.1 酶法

利用酶水解糖苷鍵，降低纖維素或多糖的分子質(zhì)量，具有反應(yīng)條件溫和，容易控制，污染小等特點[32-33]。因此酶法降解一直是多糖降解工藝研究的熱點。最常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶及淀粉酶、果膠酶等。纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶，包括內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和纖維二糖酶三種主要成分。其水解機理一般認為是纖維素大分子首先在內(nèi)切酶作用下，隨機生成寡聚糖，繼而外切酶在寡聚糖鏈的非還原性端水解，主要產(chǎn)物為纖維二糖。纖維二糖酶將其進一步水解得到葡萄糖[34-36]。半纖維素酶系包括內(nèi)切型β-1，4-木聚糖酶，外切型β-木糖苷酶及幾種輔酶，如糖苷酶和酯酶。與纖維素酶系作用機理類似，木聚糖在內(nèi)切酶作用下，降解為木寡糖；β-木糖苷酶切割木寡糖的末端而釋放木糖殘基；糖苷酶可從木聚糖主鏈上水解掉阿拉伯糖和4-O-甲基葡萄糖酸；而酯酶可水解連在木聚糖木糖單元和酚酸之間或阿拉伯糖側(cè)鏈殘基和酚酸之間的酯鍵，從而將半纖維素水解成木糖、阿拉伯糖等五碳糖[37]。酶水解不需要較高的溫度，可在常壓下進行，這樣就減少了能耗。而且酶的催化專一性很高，可形成單一產(chǎn)物，有較高的產(chǎn)率[38]。羿慶燕等采用纖維素酶法與熱水浸提相結(jié)合的方法提取大豆多糖，其最優(yōu)條件為酶解溫度50℃，酶解時間50 min，pH 5.5，酶添加量1.0%，大豆多糖含量可達14.18%[39]。王立峰等以脫脂豆粕為材料，選取堿性蛋白酶降解制備大豆多糖，最優(yōu)條件為pH 6.0，酶解溫度50℃，提取時間1.5 h，液料比分別為20∶1（mL·g-1），大豆多糖的提取率可達到17.92%[40]。

1.3.2 發(fā)酵法

發(fā)酵法是以纖維素多糖類材料為底物，進行固態(tài)發(fā)酵或液體深層發(fā)酵，通過微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸、產(chǎn)酶作用，對纖維素進行降解，使糖苷鍵斷裂，轉(zhuǎn)化為小分子多糖、葡萄糖等產(chǎn)物[41-42]。研究者們對不同微生物及微生物所產(chǎn)多糖降解酶進行了大量的篩選[43]，取得了不斷的進步。目前，國內(nèi)外有記錄的產(chǎn)纖維素酶的菌株已有53個屬的幾千個菌株。通過對降解纖維素微生物系統(tǒng)的分析，可知具有降解纖維素能力的微生物主要分布在真菌、細菌和放線菌的多種菌屬中[44-46]，其中真菌被認為是自然界中有機質(zhì)特別是纖維素物質(zhì)的主要降解者。可降解多糖、纖維物質(zhì)的微生物主要有：

1.3.2.1 真菌類

絲狀真菌是最主要的纖維物質(zhì)降解類群。研究較多的有木霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬和漆斑霉屬[47]。絲狀真菌產(chǎn)酶效率高，產(chǎn)生的多為胞外酶，同時可產(chǎn)生半纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等，是降解纖維素原料的主要微生物。目前，產(chǎn)量最多的為木霉屬，其中活性較高的代表菌種有里氏木霉、康氏木霉、綠色木霉等[15]。黃寧珍等用稀釋法和表面消毒法分別從腐爛木屑和霉變樹枝中分離纖維素降解真菌，獲得兩個菌株，編號為34和H[48]。研究兩個菌株的生物學(xué)及產(chǎn)酶特性發(fā)現(xiàn)：復(fù)雜多糖比簡單雙糖或單糖更利于菌株的生長，淀粉是它們的最佳碳源；當MS為無機鹽、濾紙或CMC-Na為碳源、pH為6.0～7.0時，兩個菌株的纖維素酶活較高；其中，真菌34的最高FPase和CMCase為144.14和325.67 U·L-1，真菌H則為111.38和328.47 U·L-1。王洪媛等篩選到3株具有較強纖維素降解能力的真菌菌株[49]，經(jīng)初步鑒定菌株98MJ為草酸青霉（Penicillium oxalicum）、菌株W3為木霉（Trichoderma sp.）、菌株W4為擴張青霉（Penicillium expansum），菌株W4具有非常強的秸稈纖維素降解能力，10 d內(nèi)對秸稈的降解率可達56.3%，對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解率分別為59.06%、78.75%和33.79%。菌株W4的胞外纖維素酶活力在14.25～49.75 U·mL-1之間。馬懷良等從長期堆放稻草的土壤中分離出12株常溫纖維素分解菌[50]。通過纖維素酶活力測定，最終篩選出對纖維素分解能力較強的木霉菌屬（Trichoderma）菌株NM5，其C1酶活力、羧甲基纖維素酶活力、濾紙酶活力分別為0.0170、0.7174和1.3435 IU·mL-1。

1.3.2.2 細菌類產(chǎn)纖維素酶的細菌屬主要包括纖維粘菌屬、生孢纖維粘菌屬、纖維桿菌和芽孢桿菌屬，代表菌種有熱纖梭菌、嗜酸纖維分解菌等。細菌產(chǎn)纖維素酶主要缺點為：纖維素酶的產(chǎn)量較少，內(nèi)切葡聚糖酶活力低；所產(chǎn)纖維素酶多為胞內(nèi)酶或吸附在細菌細胞壁上，處于類似“固定化”的狀態(tài)，提取純化困難，大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性。另外，在自然條件下，分解纖維原料很快的細菌，經(jīng)純培養(yǎng)后，

分解能力會大大下降，分解緩慢。劉晶等采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)納豆，最優(yōu)工藝條件：發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時間24 h，后熟時間為24 h[51]。黏多糖含量達5.08%。劉占英等從蒙古綿羊瘤胃內(nèi)容物中分離到一株纖維素降解細菌WH-1，對該菌株纖維素降解特性的初步研究表明，溫度37℃，pH 7.0，接種量25%、纖維二糖添加質(zhì)量占總碳源質(zhì)量的20%時，WH-1的72 h濾紙降解率達（16.81±2.99）%[52]。

1.3.2.3 其他類

放線菌中的黑紅旋絲放線菌、玫瑰色放線菌和纖維放線菌等產(chǎn)纖維素酶能力稍高。酵母自身不產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶，但可以利用酵母表達系統(tǒng)表達纖維素酶和半纖維素酶基因[53-54]，利用產(chǎn)纖維素酶工程酵母進行纖維素的發(fā)酵降解已引起不少國家的關(guān)注。

2 結(jié)語

綜上所述，目前應(yīng)用于大豆纖維多糖降解的技術(shù)主要有化學(xué)法、物理法和生物降解法三大類。其中，化學(xué)法研究較早，并已有一定的應(yīng)用。但化學(xué)方中的酸法、堿法降解往往伴隨著大量腐蝕性的酸、堿溶液應(yīng)用，對設(shè)備強度要求較高，易造成污染；氧化法存在著降解條件不易控制，降解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布差異較大，單糖相對含量較高等缺點。物理法降解纖維多糖技術(shù)的研究起步相對較晚，尤其是等離子降解技術(shù)，降解原理兼具物理、化學(xué)多種綜合作用，相對復(fù)雜一些，是目前廢水有機物降解處理技術(shù)的研究熱點。隨著研究的不斷深入，對降解條件進一步優(yōu)化，加強對多糖降解產(chǎn)物組分的控制，等離子降解有望成為一種新型的高效降解技術(shù)。生物降解法因條件溫和，容易調(diào)節(jié)，污染小，一直是近年來纖維多糖生物降解技術(shù)研究的熱點，但生物降解通常存在效果不穩(wěn)定、成本高、生產(chǎn)規(guī)模小等缺點。因此，需要生物技術(shù)、現(xiàn)代分離技術(shù)不斷發(fā)展，開發(fā)出高產(chǎn)降解酶的菌株以及高效低成本的生物酶分離提取技術(shù)，推進生物降解法的發(fā)展。另外，組合酶降解技術(shù)的開發(fā)也亟待深入研究。鑒于各種降解方法各有優(yōu)點與缺點，根據(jù)不同降解效果需要，可以考慮分步降解、聯(lián)合降解等方式，對降解方法進行組合優(yōu)化，以取得更理想的降解效果。隨著國內(nèi)外對植物多糖的研究逐步深入，不斷發(fā)現(xiàn)多種多糖及其衍生物具有很好的生物活性。多糖經(jīng)降解的產(chǎn)物，低分子質(zhì)量多糖、寡糖或單糖往往保留甚至超越多糖的生物活性，而且在水溶性方面，遠遠超過了高分子質(zhì)量多糖，使其加工特性以及生物利用率大大增加。因此，新型、高效、低成本的多糖降解技術(shù)有著很大的發(fā)展空間，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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