食品過(guò)敏原體外檢測(cè)方法研究進(jìn)展

孫秀蘭，管 露，單曉紅，張銀志

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

食物過(guò)敏（或稱食物的超敏反應(yīng)）其實(shí)就是食物引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，更確切的說(shuō)，是由食物中的過(guò)敏原所引起的[1]。食物過(guò)敏原指的是能引起免疫反應(yīng)的食物抗原分子。由免疫介導(dǎo)的食物過(guò)敏反應(yīng)一般為IgE介導(dǎo)[1]。過(guò)敏食物分為常見和不常見兩大類，聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）1995年公布的8種常見的過(guò)敏食物，分別為牛奶、雞蛋、魚、甲殼類（蝦、蟹、龍蝦）、花生、大豆、核果類（杏、板栗、腰果等）及小麥，約占食物致敏原的90%以上[2]。

食物過(guò)敏反應(yīng)可影響呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肌肉和骨骼等，有時(shí)可能產(chǎn)生過(guò)敏性休克，甚至危及生命，因此對(duì)食物過(guò)敏原的檢測(cè)是非常有必要的。同時(shí)食物過(guò)敏問(wèn)題又因人而異，不僅存在致敏原種類的差異，而且存在量的差異，有時(shí)極少量的過(guò)敏原蛋白即可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，因此這對(duì)食物過(guò)敏原蛋白定量檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了更高的要求。

現(xiàn)階段食物過(guò)敏原的檢測(cè)方法主要包括兩大類：體內(nèi)檢測(cè)和體外檢測(cè)[3]。狹義的體內(nèi)檢測(cè)就是應(yīng)用各種變應(yīng)原為患者進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，觀察患者出現(xiàn)反應(yīng)的時(shí)間和程度，從而判斷受試者對(duì)該種物質(zhì)是否過(guò)敏[4]。其主要包括皮內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)法、點(diǎn)刺試驗(yàn)檢測(cè)法、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)法和斑貼試驗(yàn)檢測(cè)法等，這類方法比較古老，試驗(yàn)部位在患者皮膚，對(duì)受試者會(huì)造成一定痛苦；而且這些實(shí)驗(yàn)均非絕對(duì)正確，其中有很多因素影響反應(yīng)結(jié)果的可靠性，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性反應(yīng)；另外體內(nèi)檢測(cè)容易導(dǎo)致患者產(chǎn)生全身過(guò)敏反應(yīng)，從而存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。而廣義的體內(nèi)檢測(cè)除了包括皮膚試驗(yàn)外，還包括食物激發(fā)試驗(yàn)，如雙盲對(duì)照食物激發(fā)實(shí)驗(yàn)（Double-blinded placebo-controlled food challenges，DBPCFC）[5]。在這類試驗(yàn)中，最重要的就是要控制安慰劑和試驗(yàn)的劑量，以能掩蓋食物的氣味、質(zhì)地，并盡量消除被檢食物與安慰劑的細(xì)微差別。但這樣就可能限制了食物的試驗(yàn)劑量，同時(shí)其結(jié)果也受多因素影響，甚至包括心理反應(yīng)。

而體外檢測(cè)是取患者血液或其他可代替的體液，亦或是其中的某些特異性成分來(lái)進(jìn)行的離體檢測(cè)，過(guò)敏原并不直接應(yīng)用于人體。故其在安全性和影響因素方面都比體內(nèi)檢測(cè)要更勝一籌，因此近年來(lái)這方面的研究越來(lái)越多。以下就體外檢測(cè)的一些方法分別加以簡(jiǎn)介。

1 免疫分析檢測(cè)技術(shù)

目前，體外檢測(cè)過(guò)敏原的方法主要是免疫分析技術(shù)[1]，它是將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代檢測(cè)手段相結(jié)合而建立的超微量測(cè)定技術(shù)，是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，突出特點(diǎn)是高度的準(zhǔn)確性和特異性。

1.1 利用人血清特異性IgE檢測(cè)食品過(guò)敏原

過(guò)敏患者的血清含有可與過(guò)敏原特異性結(jié)合的抗體，主要是IgE。利用人血清來(lái)檢測(cè)食物中的過(guò)敏原主要就是應(yīng)用血清中的抗體來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗原。這類方法一般用于臨床檢測(cè)。

1.1.1 RAST抑制試驗(yàn)和EAST抑制試驗(yàn)

在體外過(guò)敏原檢測(cè)試驗(yàn)中，放射過(guò)敏原吸附抑制試驗(yàn)（Radio allergosorbent test inhibition，RAST抑制試驗(yàn)）和酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附抑制試驗(yàn)技術(shù)（Enzyme linked allergosorbent assays inhibition，EAST抑制試驗(yàn)）[6]是目前國(guó)際上變態(tài)反應(yīng)臨床及科研人員使用最廣泛、最靈敏的方法，也是評(píng)價(jià)過(guò)敏原總致敏活性的關(guān)鍵技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是該方法的靈敏性和準(zhǔn)確性高，同時(shí)解決了不同食品過(guò)敏原的交叉致敏問(wèn)題。但RAST和EAST抑制試驗(yàn)的一個(gè)主要不足是對(duì)人血清的依賴性，由于血清難以保證一致，即同一性差，因而這兩種方法難以標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2 免疫印跡（Western blotting）

免疫印跡法[7]（Western blotting）是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。其采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用酶標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的、特異性的目的蛋白。

Satoh等從轉(zhuǎn)基因大米和非轉(zhuǎn)基因大米中提取鹽溶蛋白，用過(guò)敏患者的血清進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示兩種大米中蛋白種類幾乎無(wú)差別，也沒有檢測(cè)到已知的或新的特異性IgE結(jié)合蛋白，表明被檢的兩種大米中都無(wú)過(guò)敏原[8]。吳序櫟等采用了10位牛奶過(guò)敏患者的混合血清，來(lái)鑒定牛奶粗提液中的過(guò)敏原，發(fā)現(xiàn)了致敏原的分子質(zhì)量為34和14 ku[9]。楊睿等用魚過(guò)敏患者檢測(cè)出了帶魚中的重要過(guò)敏原蛋白，其中在分子質(zhì)量大小為54 ku處的蛋白印跡陽(yáng)性率為100%，38 ku處的陽(yáng)性率為90%，27、34 ku處的陽(yáng)性率為70%[10]。

免疫印記實(shí)驗(yàn)已成為現(xiàn)今過(guò)敏原鑒定的主要方法之一。同時(shí)也有人對(duì)其做了些許改進(jìn)，即不使用過(guò)敏患者的血清，如蔣紅玲等就使用免疫小鼠的血清作為一抗，來(lái)檢測(cè)脫脂乳浸液中的過(guò)敏原[11]；You等使用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中單克隆抗體作為一抗，來(lái)檢驗(yàn)大豆β-伴大豆球蛋白提取液中的過(guò)敏原[12]。改善后的免疫印跡法消除了對(duì)人血清的依賴性。

1.1.3 其他

臨床上還用到瓊脂凝膠雙擴(kuò)散法[4]和對(duì)流免疫電泳等體外檢測(cè)技術(shù)[4]。瓊脂凝膠雙擴(kuò)散又稱為免疫雙擴(kuò)散，其原理是免疫沉淀反應(yīng)劑中的抗原抗體，在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中，可以向周圍自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原抗體擴(kuò)散到適當(dāng)?shù)牟课欢嘤鰰r(shí)，則可生成肉眼可見的線性沉淀物—特異性抗原抗體結(jié)合物。對(duì)流免疫電泳法是在免疫雙擴(kuò)散的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)方法，它利用瓊脂電泳時(shí)產(chǎn)生的電滲現(xiàn)象，使血清中免疫球蛋白向負(fù)極移動(dòng)，與加在負(fù)極而向正極移動(dòng)的抗原相遇，形成復(fù)合物而沉積下來(lái)，若濃度合適，則會(huì)形成肉眼可見的沉淀線。

利用人血清特異性IgE來(lái)檢測(cè)過(guò)敏原的這類方法很直觀、簡(jiǎn)單，且特異性強(qiáng)，但并不適合食品過(guò)敏原的可靠檢測(cè)，因?yàn)檠逯械腎gE具有特異性，只針對(duì)被提取者，而且所提取血清的量也有限。此外，血清中的免疫球蛋白不單只有IgE一種，每種免疫球蛋白都可能對(duì)多種過(guò)敏原存在交叉反應(yīng)。

1.2 用單克隆抗體或多克隆抗體檢測(cè)食品過(guò)敏原

為了克服用人血清IgE抗體檢測(cè)食品過(guò)敏原的不足，依賴于如兔、鼠、綿羊、山羊、雞等動(dòng)物抗血清的免疫分析方法逐漸發(fā)展起來(lái)。這些抗體檢測(cè)激發(fā)免疫作用抗原的效果要比人血清好，且比較易得。

1.2.1 免疫層析法

免疫層析法[13]（Immunochromatography）是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。

Puerta等運(yùn)用夾心酶標(biāo)免疫親和層析法（ELIAC）檢測(cè)市售低致敏嬰兒配方食品中的β-乳球蛋白和其致敏肽段，β-乳球蛋白在pM到μM的水平上都可以被檢出[14]，而分子質(zhì)量低于3 000的β-乳球蛋白肽段也顯示出過(guò)敏原性，可見該方法是很靈敏的。

免疫層析法中免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)（Immunogold labeling technique）[15]的應(yīng)用較為廣泛。其是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)借靜電吸引而形成牢固結(jié)合。金顆粒具有高電子密度的特性，在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，可用于定量或半定量。依據(jù)雙抗夾心ELISA法，吉坤美等把膠體金-抗花生總蛋白抗體固定于吸水纖維部分，待測(cè)花生過(guò)敏原與膠體金-抗花生總蛋白抗體形成復(fù)合物，被包被在硝化纖維膜檢測(cè)線上的鼠抗花生總蛋白抗體捕獲濃集成紅色，可檢測(cè)花生的主要過(guò)敏原組分Ara h 1與Ara h 2，靈敏度達(dá)50 ng·mL-1[16]。另外，該研究組還應(yīng)用建立的免疫層析法對(duì)食物標(biāo)簽標(biāo)注的含有花生成分、未含花生成分以及標(biāo)注不詳?shù)?9種食品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)17種食品的檢測(cè)結(jié)果與食物標(biāo)簽的內(nèi)容相符合,2種標(biāo)示不詳?shù)氖称窓z測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明該方法特異性強(qiáng)，對(duì)于是否含有花生過(guò)敏原成分的食物檢測(cè)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

由于免疫層析技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，近年來(lái)，其在食物過(guò)敏原檢測(cè)中得到了快速發(fā)展，但多集中在花生、榛子等堅(jiān)果類過(guò)敏原的研究。另外，免疫層析檢測(cè)試紙條也進(jìn)入市場(chǎng)，加入了快檢的行列。但該技術(shù)多為定性或半定量檢測(cè)，有待于進(jìn)一步的發(fā)展。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是一種將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合的免疫分析方法，其檢測(cè)特異性源于抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)。ELISA的分類方法眾多，主要有雙抗體夾心法、間接法、捕獲法和競(jìng)爭(zhēng)法，其中，雙抗夾心ELISA法和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法應(yīng)用最為廣泛。

Jeoung等用雙抗夾心ELISA法來(lái)定量褐蝦的主要過(guò)敏原Pen a 1（原肌球蛋白）[17]。實(shí)驗(yàn)中采用了兩種針對(duì)Pen a 1不同表位的特異性單克隆抗體，其中一種作為包被抗體，而另一種則連接生物素用以檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到的Pen a 1的線性范圍在4～125 ng·mL-1。You等應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定大豆及其產(chǎn)品中的β-伴大豆球蛋白[12]。其用相當(dāng)于β-伴大豆球蛋白一個(gè)表位的合成肽與牛血清白蛋白的復(fù)合物作為包被抗原，以單克隆抗體作為一抗與之結(jié)合，測(cè)得的IC50值為4.7 ng·mL-1，檢測(cè)限為2.0 ng·mL-1，同時(shí)β-伴大豆球蛋白的回收試驗(yàn)也表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性。張?jiān)谲姷萚18]利用斑點(diǎn)ELISA法（Dot-ELISA）對(duì)花生、蝦和雞蛋清中過(guò)敏原的檢測(cè)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dot-ELISA法可以同時(shí)測(cè)定多種過(guò)敏原，且具有簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏、重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

近年來(lái)，市場(chǎng)上已有多種商品化的過(guò)敏原檢測(cè)ELISA試劑盒銷售，這些試劑盒可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原的定性和半定量檢測(cè)。ELISA法靈敏性高、特異性強(qiáng)、快速、費(fèi)用低，因而在過(guò)敏原檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，特別適用于食物中少量存在就能引起嚴(yán)重過(guò)敏癥狀的過(guò)敏原檢測(cè)。但其局限性在于食品在處理過(guò)程中可能會(huì)引起蛋白成分的破壞，而導(dǎo)致ELISA法假陰性的出現(xiàn)。

1.2.3 熒光免疫檢測(cè)

熒光免疫檢測(cè)是ELISA方法的延伸，只是在物質(zhì)分析中采用熒光信號(hào)，熒光信號(hào)發(fā)生物主要是異硫氰酸酯和羅丹明。熒光免疫檢測(cè)的種類很多，但近年來(lái)時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)（TRFIA）使用得更為廣泛，其是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來(lái)的的一種公認(rèn)的最有發(fā)展前途的非放射免疫標(biāo)記技術(shù)。

TRFIA[19]是用鑭系金屬離子作為示蹤物標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，與其螯合劑、增強(qiáng)液（有些不需要）在待反應(yīng)體系（如抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等）發(fā)生反應(yīng)后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度比值，推測(cè)反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。

劉志剛等建立了雙抗夾心時(shí)間分辨熒光免疫法來(lái)測(cè)定食品中花生過(guò)敏原蛋白成分[19]。其用Eu3+標(biāo)記鏈霉親和素，并以β-二酮體作為增強(qiáng)劑，發(fā)現(xiàn)該方法特異性強(qiáng)，最低檢出限為0.1 ng·mL-1，在0.1～160 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好。Faste等用時(shí)間分辨熒光免疫法來(lái)檢測(cè)食品中的榛子蛋白，其用銪的螯合物的熒光特性來(lái)提高信噪比，以降低基質(zhì)干擾和提高靈敏度[20]。該方法適用于痕量分析，其檢測(cè)限達(dá)0.1 mg·mL-1，定量限為0.33 mg·mL-1，在餅干和谷類食品中的回收率為73%～123%，在巧克力中的回收率為50%～77%。另外該研究組還用此方法測(cè)了挪威市售的標(biāo)有“可能含榛子”的100種食品，其中有36種榛子蛋白含量小于0.2 mg·kg-1，有7種含量超過(guò)10 mg·kg-1。

時(shí)間分辨熒光免疫法是一種高度靈敏的免疫分析技術(shù)，具有檢測(cè)范圍寬、對(duì)標(biāo)記物分子生物活性影響小、無(wú)放射性污染、標(biāo)記物保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。適合于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等超微量分析，目前已經(jīng)推出幾十種商品化的試劑盒。

1.2.4 免疫傳感器檢測(cè)技術(shù)

免疫傳感器技術(shù)[21]是將傳統(tǒng)的免疫測(cè)試結(jié)果通過(guò)傳感器轉(zhuǎn)換為精密的數(shù)字輸出，不但能達(dá)到定量檢測(cè)的效果，還能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)到表面的抗原抗體反應(yīng)。免疫傳感器技術(shù)具有方便、省時(shí)、精度高、便于計(jì)算機(jī)收集和處理數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)，又不會(huì)或很少損傷樣品和造成污染，易于推廣普及。

Liu等制備了電化學(xué)免疫傳感器來(lái)檢測(cè)花生過(guò)敏原的抗體，測(cè)定方法用到了安培測(cè)定和EIS檢測(cè)[22]。該方法檢測(cè)限達(dá)5 pg·mL-1，IgY濃度為5 pg·mL-1到1 μg·mL-1范圍內(nèi)線性較好。沈麗燕用1，6-己二硫醇（HDT）-納米金自主裝金電極，包被IgE抗體后制成壓電免疫傳感器，檢測(cè)花生跟河蝦中的過(guò)敏原[23]，結(jié)果顯示，河蝦蛋白的最低檢測(cè)限為0.03 μg·mL-1，花生蛋白的最低檢測(cè)限為0.2 μg·mL-1，表明該傳感器具有較高的靈敏度。寧煒也應(yīng)用這種自主裝的壓電免疫傳感器對(duì)花生和河蝦過(guò)敏原進(jìn)行了同步篩檢，實(shí)驗(yàn)證明該方法回收率高，重現(xiàn)性好[24]。

目前免疫傳感器正處于快速研發(fā)階段，電極表面的自主裝材料也是一個(gè)發(fā)展方向，汪忠云[26]將四乙氧基硅在鹽酸催化下水解形成的硅溶膠、離子液體和黃曲霉毒素B1（AFB1）抗體混合后涂于玻碳電極表面制成非標(biāo)記型抗體免疫傳感器。此外還有很多研究者都在探索新的、更好的自主裝材料，比如磁小體[27-28]就有可能成為一種新型的耦合載體，以及石墨烯[29]、量子點(diǎn)[30]、碳納米管[30]等納米材料都已被開發(fā)加以運(yùn)用。

2 非免疫分析檢測(cè)技術(shù)

2.1 PCR檢測(cè)

DNA比蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性高，在食品加工中更耐加熱和加壓處理，且只要有微量的目的基因就可以擴(kuò)增出高于檢測(cè)限的含量，因此PCR檢測(cè)方法可以克服蛋白含量低而被食品基質(zhì)掩蓋的缺點(diǎn)。同時(shí)DNA的特異性也較高，因此PCR可以用于一些過(guò)敏原含量低或者成分復(fù)雜的食品的檢測(cè)。

Torp等采用半定量PCR方法來(lái)檢測(cè)大豆過(guò)敏原Gly m Bd 30k的DNA序列，該方法的檢測(cè)限達(dá)到0.01%[28]。Galan等用實(shí)時(shí)定量PCR法同時(shí)檢測(cè)加工食品中羽扇豆和大豆的線粒體DNA，并將其作為過(guò)敏原的存在標(biāo)志[29]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法產(chǎn)生的結(jié)果具有一致性和可重復(fù)性，特異性較高，且其靈敏度適于過(guò)敏成分含量在較低的mg·kg-1范圍內(nèi)的食品。史艷宇等也采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法來(lái)檢測(cè)食品中的痕量蕎麥成分，發(fā)現(xiàn)該方法能有效而快速地進(jìn)行檢測(cè)，且特異性強(qiáng)，靈敏度高[30]。

PCR方法靈敏、穩(wěn)定性好，檢測(cè)速度較快，但其不足之處在于PCR產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，紫外光觀察結(jié)果，或通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)，需要多種儀器，實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁雜，更重要的是容易造成污染和出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。

2.2 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)（Mass spectrometry）主要是針對(duì)分子間的非共價(jià)鍵反應(yīng)如抗原抗體間的特異性結(jié)合進(jìn)行分析，其具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，已得到廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)可用于過(guò)敏原表位的定位，也可用過(guò)過(guò)敏原的定量測(cè)定。宋益銀等對(duì)鋸緣青蟹中的過(guò)敏原進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)[31]，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)肽段有酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，是過(guò)敏原參與機(jī)體反應(yīng)的重要活性位點(diǎn)。Webe等使用同位素標(biāo)記酪蛋白肽段，通過(guò)質(zhì)譜分析，在餅干中可定量檢測(cè)出1.25 μg·g-1的酪蛋白[32]。但質(zhì)譜分析必須要有專門的儀器來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，且其樣品處理比較繁瑣。

2.3 其他

生物芯片技術(shù)是通過(guò)縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。目前，生物芯片技術(shù)逐漸進(jìn)入了食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，用于過(guò)敏原檢測(cè)的生物芯片主要是蛋白質(zhì)芯片，利用熒光標(biāo)記的靈敏性和抗原抗體結(jié)合的特異性來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。Harwanegg等建立了以生物芯片免疫分析為基礎(chǔ)的過(guò)敏原微陣列技術(shù)，對(duì)雞蛋、牛奶特異性IgE進(jìn)行檢測(cè)[33]。Lin等應(yīng)用牛奶過(guò)敏蛋白肽段，建立了一個(gè)可靠、敏感的肽微陣列免疫檢測(cè)技術(shù)，以得到大量食物過(guò)敏原的表征圖譜[34]。生物芯片技術(shù)應(yīng)用于食品安全檢測(cè)，具有快速、微型化、自動(dòng)化、高通量、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)；但是，檢測(cè)成本高，芯片上多種探針的存在容易造成假陽(yáng)性的結(jié)果。盡管存在諸多問(wèn)題，其發(fā)展前景仍然十分廣闊[35-36]。

中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖，是一種綜合的、可量化的鑒定手段。吳海強(qiáng)等首次提出將指紋圖譜應(yīng)用到食品過(guò)敏原的快速檢測(cè)分析[37-39]，他們提取魚、河蝦、花生中的過(guò)敏原總蛋白，進(jìn)行2-DE指紋圖譜分析，從而確定了食品過(guò)敏原指紋圖譜快速檢測(cè)的可行性，為進(jìn)一步鑒定過(guò)敏原提供基礎(chǔ)。

3 展 望

食品過(guò)敏原的檢測(cè)已經(jīng)逐漸成為食品安全檢測(cè)的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題，相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)也在不斷的發(fā)展，目前常用的檢測(cè)方法都各有其優(yōu)點(diǎn)和不足，而將數(shù)種檢測(cè)方法相結(jié)合，則能更為有效地檢測(cè)食品中常見的過(guò)敏原甚至是潛在的過(guò)敏原。Chassaigne等用熒光二維微分凝膠電泳、western blotting以及Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)合對(duì)花生提取液中的過(guò)敏原進(jìn)行分析，鑒定出花生過(guò)敏原Ara h 1、Ara h 2以及Ara h 3/4[40]。Bettazzi等結(jié)合DNA芯片技術(shù)和PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)榛子中的過(guò)敏原[41]。本文也將會(huì)結(jié)合ELISA、PCR、免疫傳感器等方法建立食品中過(guò)敏原的評(píng)價(jià)模式，來(lái)檢測(cè)魚、牛奶、大豆、雞蛋中的過(guò)敏原，以期實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、安全、快速、高靈敏的檢測(cè)。

此外，隨著貿(mào)易全球化的發(fā)展，不同地域間食物的相互流通以及深加工技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得過(guò)敏人群接觸食物中過(guò)敏原的種類日益增多，因此開發(fā)高通量、高靈敏度以及快速的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法也勢(shì)在必行。

[1]胥傳來(lái).食品免疫學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007:121-150.

[2]FAO.Report of the FAO Technical Consultation on Food Allergies[C].Rome:Food and Agriculture Organization,1995.

[3]Lars K.Poulsen.In vivo and in vitro techniques to determine the biological activity of food allergens[J].Journal of Chromatography B,2001,756:41-55.

[4]喬秉善.變態(tài)反應(yīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2002:103-144.

[5]Matthias Besler.Determination of allergen in foods[J].Trends in Analytical Chemistry,2001,20(11):662-672.

[6]Graham Roberts,D M,Lack G,et al.Diagnosing peanut allergy with skin prick and specific IgE testing[J].J Allergy Clin Immunol,2005,115(6):1291-1296.

[7]Biji T.Kurien,R.Scofield H.Western blotting[J].Methods,2006,38:283-293.

[8]Satoh R,Nakamura R,Komatsu A,et al.Proteomic analysis of known and candidate rice allergens between non-transgenic and transgenic plants[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2011,59:437-444.

[9]吳序櫟,袁小平,劉志剛,等.牛奶過(guò)敏原的分離、鑒定與純化[J].中國(guó)乳品工業(yè),2008,36(12):15-17.

[10]楊睿,吳海強(qiáng),劉志剛,等.帶魚過(guò)敏原的分離、鑒定與純化[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2008,8(11):1112-1115.

[11]蔣紅玲,向軍檢,王宏,等.牛奶中過(guò)敏原組分的分離純化及主要過(guò)敏原的鑒定[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,29(4):341-346.

[12]You J M,Li D F,Qi S Y,et al.Development of a monoclonal antibody-based competitive ELISA for detection ofβ-conglycinin,an allergen from soybean[J].Food Chemistry,2008,106:352-360.

[13]Ono T,Kawamura M,Arao S,et al.A highly sensitive quantitative immunochromatography assay for antigen-specific IgE[J].Journal of Immunological Methods,2003,272:211-218.

[14]Puerta A,Diez-Masa J C,de Frutos M.Immunochromatographic determination of β-lactoglobulin and its antigenic peptides in hypoallergenic formulas[J].International Dairy Journal,2006,16:406-414.

[15]Hiemori M,Ito H,Kimoto M,et al.Identification of the 23-ku peptide derived from the precursor of Gly m Bd 28K,a major soybean allergen,as a new allergen[J].Biochimica et Bio-physica Acta,2004,1675:174-183.

[16]吉坤美,陳家杰,詹群珊,等.膠體金免疫層析法檢測(cè)食品中花生過(guò)敏原蛋白成分[J].食品研究與開發(fā),2009,30(5):101-105.

[17]Byeoung-Ju Jeoung,Reese G,Hauck P,et al.Quan-tification of the major brown shrimp allergen Pen a 1(tropomyosin)by a monoclonal antibody-based sandwich ELISA[J].J Allergy Clin Immunol,1997,100(2):229-234.

[18]張?jiān)谲?毛露甜,向軍檢,等.Dot-ELISA法同時(shí)檢測(cè)多種食品過(guò)敏原的實(shí)驗(yàn)研究[J].食品科技,2005(4):69-74.

[19]劉志剛,李佳娜,顧耀亮,等.時(shí)間分辨免疫熒光法測(cè)定食物中花生過(guò)敏原成分[J].食品科技,2010,35(2):241-245.

[20]Faeste C K,Holden L,Plassen C,et al.Sensitive time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of hazelnut(Corylus avellana)protein traces in food matrices[J].Journal of Immunological Methods,2006,314:114-122.

[21]Yin Huang,Melissa C.Bell,Ian I.Suni.Impedance Biosensor for Peanut Protein Ara h 1[J].Anal Chem,2008,80:9157-9161.

[22]Hongyun Liu,Ruchika Malhotra,Mark W Peczuh,et al.Electrochemical immunosensors for antibodies to peanut allergy ara h2 using gold nanoparticle-peptide films[J].Anal Chem.2010,82:5865-5871.

[23]沈麗燕.食品過(guò)敏原壓電型免疫傳感快速檢測(cè)技術(shù)的研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2008.

[24]寧煒.花生、河蝦過(guò)敏原抗體的制備及壓電免疫傳感同步檢測(cè)[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2009.

[25]汪忠云.離子液體介導(dǎo)免疫傳感器的研制[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2009.

[26]Matsunaga T,Ueki F,Obata K,et al.Fully automated immunoassay system of endocrine disrupting chemicals using monoclonal antibodies chemically conjugated to bacterial magnetic particles[J].Anal Chem Acta,2003,475:75-83.

[27]Kuhara M,Takeyama H,Tanaka T,et al.Magnetic cell separation using antibody binding with protein A expressed on bacterial magnetic particles[J].Anal Chem,2004,76:6207-6213.

[28]Torp A M,Olesen A,Sten E,et al.Specific,semi-quantitative detection of the soybean allergen Gly m Bd 30K DNA by PCR[J].Food Control,2006,17:30-36.

[29]Antonio M.Gomez Galan,Marcel Brohee,Eugenia de Andrade Silva,et al.Development of a real-time PCR method for the simultaneous detection of soya and lupin mitochondrial DNA as markers for the presence of allergens in processed food[J].Food Chemistry,2011,127:834-841.

[30]史艷宇,劉金華,逄曉陽(yáng),等.實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)食品中痕量蕎麥成分[J].食品科學(xué),2009,30(20):312-315.

[31]宋益銀,林蕾,蘇秀榕,等.鋸緣青蟹(Scylla serrata)特異性過(guò)敏原的研究[J].海洋與湖沼,2009,40(1):62-67.

[32]Weber D,Raymond P,Ben Rejeb S,et al.Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method using capillary liquid chromatography and nanoelectrospray ionizationquadrupole time-of-flight hybrid mass spectrometer for the detection of milk allergens[J].J Agric Food Chem,2006,54(5):1604-1610.

[33]Harwanegg C,Hutter S,Hiller R.Allergen microarrays for the diagnosis of specific IgE against components of cow's milk and hen's egg in a multiplex biochip-based immunoassay[J].Methods Mol Biol,2007,385(1):145-157.

[34]Jing Lin,Ludmilla Bardina,Wayne G.Shreffler,et al.Development of a novel peptide microarray for large-scale epitope mapping of food allergens[J].J Allergen Clin Immunol,2009,124(2):315-322.

[35]Roy S,Sen C K.cDNA microarray screening in food safety[J].Toxicology,2006,3(1):128-133.

[36]Liu-Stratton Y,Roy S,Sen C K.DNA microarray technology in nutraceutical and food safety[J].Toxicology,2004,150(1):29-42.

[37]吳海強(qiáng),余曉,劉志剛.食品過(guò)敏原指紋圖譜快速檢測(cè)研究-鯽魚、鰱魚總蛋白2-DE指紋圖譜分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2006,6(1):10-12.

[38]吳海強(qiáng),余曉,劉志剛.食品過(guò)敏原指紋圖譜快速檢測(cè)研究-河蝦總蛋白2-DE指紋圖譜重現(xiàn)性分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2006,6(2):131-134.

[39]吳海強(qiáng),余曉,劉志剛.食品過(guò)敏原指紋圖譜快速檢測(cè)研究-花生總蛋白2-DE指紋圖譜和蛋白點(diǎn)MALDI-TOF/MS分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2006,6(3):271-274.

[40]Chassaigne H,Tregoat V,Jorgen V,et al.Resolution and identification of major peanut allergens using a combination of fluorescence two-dimensional differential ge electrophoresis,Western blotting and Q-TOF mass spectrometry[J].Journal of Proteomics,2009,72:511-526.

[41]Bettazzi F,Lucarelli F,Palchetti I,et al.Dis-posable electrochemical DNA-array for PCR amplified detection of hazelnut allergens in foodstuffs[J].Analytica Chimica Acta,2008,614:93-102.