細胞DNA修復系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生及化療耐藥性

呂 申

(大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 實驗中心，遼寧 大連 116027)

基因組完整與穩(wěn)定是維持細胞正常生存行使功能的基礎。在生命過程中，人類細胞基因組總是不可避免地會受到來自體內(nèi)外環(huán)境的物理、化學、生物等因子的損傷，如：紫外線、放射線、煙霧、細胞代謝產(chǎn)生的氧自由基、病毒等。同時在細胞增殖的DNA復制過程基因組也會發(fā)生一些錯誤。為了維持基因組的穩(wěn)定，生物體在進化過程中形成了一整套完整的DNA損傷修復系統(tǒng)。這一系統(tǒng)中的DNA損傷修復方式主要有3種：核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)、堿基切除修復(base excision repair, BER)和DNA錯配修復(mismatch repair, MMR)。這些修復方式所涉及參與DNA修復的基因有130多個，如切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementing gene l, ERCC1 )、X線修復交叉互補基因1(X- ray cross-complementing gene l, XRCC1)、多個錯配修復基因、O6-甲基鳥嘌呤- DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(MGMT)等。這些基因中的某一個或某幾個出現(xiàn)結構或功能異常時，細胞的DNA修復功能就會發(fā)生缺欠，進而細胞基因組中未能得以修復的“錯誤”將不斷積累，細胞基因組的完整性和穩(wěn)定性也就難以得到保證。這些“錯誤”將可能使一些抑癌基因失活，也可能使一些原癌基因被激活，最終導致腫瘤發(fā)生。近年來人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的DNA修復功能狀態(tài)不僅與腫瘤發(fā)生相關，也與腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生有關。

1 ERCC1基因

1.1 ERCC1基因結構、功能及多態(tài)性

ERCC1基因定位于染色體的19q13.32，全長15 kb，含有10個外顯子。該基因編碼的蛋白分子量為32.5 kDa，由297個氨基酸組成，是一種高度保守的單鏈DNA核酸內(nèi)切酶，是核苷酸切除修復系統(tǒng)中的主要蛋白。ERCC1蛋白通過與其他的修復蛋白形成蛋白復合體，發(fā)揮識別損傷DNA 的5’端及5’- 3’核酸內(nèi)切酶活性，參與修復由紫外線引起的嘧啶二聚體、大分子化學加合物及一些其他光產(chǎn)物引起的DNA損傷。

ERCC1基因比較常見的單核苷酸多態(tài)有兩種，分別為第4外顯子的T19007C和3’非編碼區(qū)的C8092A。目前，報道較多的是第4外顯子的T19007C，它會導致118號密碼子的編碼序列發(fā)生改變。雖然118號密碼子的編碼序列發(fā)生了改變后的編碼氨基酸仍然是天冬酰胺，但值得注意的是，這一轉(zhuǎn)變使ERCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，細胞的ERCC1蛋白表達也隨之降低，最終引起細胞核苷酸切除修復能力的降低。ERCC1基因3’非編碼區(qū)的C8092A轉(zhuǎn)變可能通過使ERCC1 mRNA轉(zhuǎn)錄受到抑制或者使mRNA穩(wěn)定性降低而導致細胞的DNA核苷酸切除修復能力降低。

1.2 ERCC1基因異常與腫瘤發(fā)生

目前，關于ERCC1基因多態(tài)性與人類腫瘤發(fā)病風險關系的研究有很多，但研究結果尚不統(tǒng)一。種族或腫瘤類型常使研究結果出現(xiàn)分歧。Zienolddiny S等[1]發(fā)現(xiàn)，ERCC1基因T19007C多態(tài)性與挪威人非小細胞肺癌發(fā)病有關，而Zhou W、Matullo G及Vogel U等[2-4]則認為該多態(tài)與丹麥人、美國人及不吸煙歐洲人的非小細胞肺癌發(fā)病無關。Jo H及Han SS等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1基因T19007C多態(tài)性與韓國人群卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌發(fā)病均無關，而且在后來的研究中該實驗組也并未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與韓國人群宮頸癌發(fā)病有關。另外，Sturgis EM及Yang ZH等[7-8]研究提出，ERCC1基因的C8092A多態(tài)性與美國人群的頭頸鱗狀細胞癌及中國人群的鼻咽癌發(fā)病密切相關，但Zienolddiny S及Weiss JM等[1,9]研究者則發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性與挪威人群非小細胞肺癌及美國人群子宮內(nèi)膜癌發(fā)病無關。

1.3 ERCC1基因與化療

鉑類是常見的抗腫瘤藥物之一，其作用的靶點為細胞內(nèi)的DNA，通過形成鉑-DNA加合物，破壞DNA的結構，抑制DNA的復制及轉(zhuǎn)錄，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。如前所述，ERCC1蛋白參與修復一些大分子加合物引起的DNA損傷，理論上該蛋白可以使細胞內(nèi)的鉑-DNA加合物得以有效清除，導致腫瘤細胞對鉑類耐藥。這一理論已被一些研究結果證實。 Kawashima A等[10]檢測了4例體外培養(yǎng)膀胱癌細胞株(其中2例為順鉑耐藥株)的ERCC1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥細胞的ERCC1蛋白表達水平高于非耐藥株；一些學者對卵巢癌細胞株的研究也證實，順鉑耐藥的細胞株ERCC1 mRNA及蛋白表達水平均高于未接受化療的細胞株[11]；Olaussen等[12]進行的臨床試驗觀察發(fā)現(xiàn)，與ERCC1蛋白表達陽性非小細胞肺癌的患者相比，該蛋白表達陰性的患者更容易從以順鉑為主的化療中受益；Bellmunt等[13]也報道，以順鉑進行治療的ERCC1 mRNA 低水平的進展期膀胱癌患者預后明顯優(yōu)于ERCC1 mRNA 高水平的患者。由此提示，ERCC1 mRNA或蛋白表達水平的高低對篩選鉑類治療腫瘤患者的敏感人群具有一定的指導作用。

2 XRCC1基因

2.1 XRCC1基因結構、功能與多態(tài)性

XRCC1基因是第一個被克隆出來的參與單鏈斷裂修復的人類基因，它定位于染色體的19q13.2，全長33 kb，含有17個外顯子。其編碼蛋白由633個氨基酸組成，分子量為70 kDa，在大腸組織表達水平較高，而在其它組織的表達水平較低。XRCC1蛋白表達較低的細胞對電離輻射、過氧化氫、烷化劑等損傷的敏感性較高。XRCC1蛋白是堿基切除修復系統(tǒng)的主要蛋白，雖然本身沒有催化酶的活性，但是它具有的三個功能區(qū)可以與DNA連接酶III、DNA聚合酶β、聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶(PARP)結合形成復合物，修復由氧化劑、電離輻射及烷化劑引起的堿基損傷及DNA單鏈斷裂。

對XRCC1基因DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因有300多個單核苷酸多態(tài)性位點，其中約有35個多態(tài)位點位于外顯子或啟動子區(qū)域。研究最多的3個單核苷酸多態(tài)性位點分別是第6外顯子的C26304T、第9外顯子的G27466A和第10外顯子的G28152A。它們可以導致氨基酸殘基發(fā)生相應的改變(Arg194Trp、Arg280His 、Arg399Gln)。這些編碼區(qū)氨基酸序列的改變通過影響XRCC1蛋白與BER系統(tǒng)中其它蛋白的相互作用使細胞的DNA修復功能發(fā)生變化。

2.2 XRCC1基因與腫瘤發(fā)生

大量研究結果表明一些基因的多態(tài)性可能影響人群的腫瘤發(fā)病風險。目前，雖然XRCC1基因單核苷酸多態(tài)與腫瘤易感性的相關研究較多，但研究結果尚未得到共識。該基因的同一種單核苷酸多態(tài)可以增加一些腫瘤的發(fā)病風險，但卻能降低另一些腫瘤的發(fā)病風險。例如，Arg194Trp單核苷酸多態(tài)可以增加食管癌及膽管癌的發(fā)病風險，但可以降低胃癌的發(fā)病風險；Arg280His單核苷酸多態(tài)被認為與乳腺癌發(fā)病風險增加有關，而與膽管癌發(fā)病風險降低有關；Arg399Gln單核苷酸多態(tài)被認為與日本人女性子宮頸癌易感性增高有關。

Hung RJ 等[14]對來自三項研究的2 188例肺癌病例及2198例對照進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)Arg194Trp、Arg280His 和Arg399Gln三種單核苷酸多態(tài)均與肺癌發(fā)病風險的關聯(lián)不大，但根據(jù)吸煙量進行分組研究時發(fā)現(xiàn)，在重度吸煙組(每年吸煙量>38.26包)，Arg194Trp和Arg280His的單核苷酸多態(tài)與肺癌發(fā)病風險降低有關。Susana N等[15]報告，Arg194Trp與Arg399Gln單核苷酸多態(tài)與乳腺癌發(fā)病風險關聯(lián)不大，一些研究者也發(fā)表了相似的研究結果，但一項印度的研究卻報道這兩個位點的單核苷酸多態(tài)與乳腺癌發(fā)病風險增高相關[16-18]。這些研究結果的差異可能與不同地區(qū)、不同人種XRCC1基因多態(tài)性發(fā)生頻率高低有關。Susana N等進一步研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)年齡在45～55歲之間患者的Arg194Trp單核苷酸多態(tài)及絕經(jīng)年齡55歲以上患者的Arg399Gln單核苷酸多態(tài)會顯著增加乳腺癌發(fā)病風險。該發(fā)現(xiàn)提示女性絕經(jīng)狀態(tài)可能是影響XRCC1蛋白修復功能的一個重要因素。

2.3 XRCC1基因與化療

鑒于XRCC1基因多態(tài)性會影響細胞的DNA修復能力，該基因常見的單核苷酸多態(tài)與腫瘤化療反應的關系已引起了研究者們的關注。多項研究結果提示XRCC1基因多態(tài)性的確與多種腫瘤的化療反應有關，但研究結果仍然存在一些分歧。Wang等[19]對接受鉑類藥物化療的105例非小細胞肺癌患者進行臨床研究發(fā)現(xiàn)，攜帶194Trp/Trp或194Arg/Trp基因型患者的化療效果明顯優(yōu)于攜帶194Arg/Arg基因型患者，而攜帶399Arg/Arg基因型患者的化療效果明顯優(yōu)于攜帶399 Arg/Gln或399Gln/Gln基因型患者；Shi MQ等[20]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶194Arg/Arg基因型的進展期肺癌患者對鉑類藥物化療的耐藥風險是攜帶194Trp/Trp基因型患者的5倍，但沒有發(fā)現(xiàn)399密碼子多態(tài)與患者化療反應有關；Moreno V等[21]報道，攜帶399Gln/Gln基因型的大腸癌患者的化療反應優(yōu)于攜帶399Arg/Arg或399 Arg/Gln患者。盡管造成上述結果的差異尚未完全清楚，但檢測XRCC1基因多態(tài)及其蛋白表達將可能會對篩選某些細胞毒性藥物的受益人群有所幫助。

3 MMR基因

3.1 MMR基因結構與功能

MMR主要參與修復DNA復制過程中形成的單堿基錯配及插入/缺失環(huán)。 MMR系統(tǒng)中識別錯配DNA的MutS同源物命名為hMSH(human MutS homologs)，主要包括hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6，構成兩種異源二聚體：MutSα和MutSβ。MutSα由hMSH2和hMSH6構成，主要功能是識別單堿基錯配(G/T，A/C)、短的插入/缺失環(huán)，同時還能誘導細胞凋亡，是MutS的主要功能行使者；MutSβ由hMSH2和hMSH3組成，主要功能是識別較大的插入/缺失環(huán)，這兩種復合物的功能具有一定程度的重疊。MMR系統(tǒng)中的MutL同源物命名為hMLH(human MutL homologs)，主要包括hMLH1、hPMS1、hPMS2，構成三種異源二聚體：MutLα、MutLβ和MutLχ。MutLα由hMLH1和hPMS2構成，是hMLH最主要的異源二聚體形式，主要參與糾正單堿基錯配及插入/缺失環(huán)，也在細胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用；MutLβ由hMLH1和hPMS1構成，該復合物在人類DNA錯配修復過程中的具體作用尚不明確；MutLχ由hMLH1和hMLH3構成，由于hMLH3的缺失并不會損傷MMR系統(tǒng)的功能，因此MutLχ并不是細胞DNA錯配修復所必須的。值得注意的是，hMSH2及hMLH1是上述多種復合物的基本成員，二者中任何一個出現(xiàn)結構或功能的異常均可能導致細胞MMR功能的降低甚至喪失。而復合物中的其他成員丟失(如hMSH6)只會減弱MMR系統(tǒng)糾正單堿基錯配及插入/缺失環(huán)的功能。

3.2 MMR基因與腫瘤發(fā)生

MMR系統(tǒng)功能缺失可以由突變、缺失或錯配修復基因后天性沉默等多種因素引起。MMR功能缺失使細胞不能有效修復DNA復制時出現(xiàn)的錯誤，這些錯誤的累積造成基因突變發(fā)生頻率的增高，進而導致細胞基因組的不穩(wěn)定，尤其見于DNA序列中的一些短串聯(lián)重復序列(微衛(wèi)星)，即，微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)。研究證實，MMR功能缺失普遍見于大腸癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤[22-25]。HNPCC的MMR功能缺失主要是由于錯配修復基因hMLH1、hMSH2及hMSH6突變引起的，hMLH1、hMSH2突變約占所有突變的90%，hMSH6突變占所有突變的10%。散發(fā)性大腸癌MMR功能缺失則是由hMLH1啟動子超甲基化引起的基因沉默所致。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌等消化道腫瘤以及肺癌腫瘤細胞常出現(xiàn)MMR蛋白表達的增高[26-29]。這與他人的一些研究結果好像存在一定的差異，在邏輯上似乎也存在一定的矛盾。人們一定會問： MMR蛋白表達增高細胞基因組中的突變怎么還會增多？如果從相反的方向考慮，將可能得到比較合理的解釋。腫瘤細胞多處于DNA復制的細胞增殖狀態(tài)，此時細胞基因組中的堿基錯配增多，基因組穩(wěn)定性減弱，為維護細胞的基因組穩(wěn)定性及遺傳保真性，細胞需要通過加強MMR蛋白表達來增強對錯配的修復，也就是說腫瘤細胞中的MMR蛋白表達增多可能是堿基錯配增多的結果，而不是原因?？梢?，MMR蛋白表達的增高和降低均可能成為腫瘤預警的標志。

3.3 MMR基因與化療

大量體外實驗提示，MMR功能缺失與腫瘤的鉑類藥物耐藥發(fā)生有關。研究發(fā)現(xiàn)，hMLH1功能缺失的大腸癌細胞株HCT116和hMSH2功能缺失的子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC59對順鉑耐藥程度分別是hMLH1和 hMSH2功能正常細胞株的2.1倍和1.8倍[30]。這可能是由于MMR功能缺失除了能夠引起非編碼序列的突變外，也能引起控制藥物敏感性基因的突變，從而引起對化療藥物耐藥。也有學者提出了無效循環(huán)模型來解釋為什么與MMR功能正常的腫瘤細胞相比，MMR功能缺失的腫瘤細胞更易出現(xiàn)對化療藥物耐藥現(xiàn)象，這可能是由于MMR功能正常時能夠識別并切除鉑類藥物引起的DNA損傷，另一條鏈仍然被保存，并作為模板鏈進行新DNA鏈的合成，但由于DNA損傷仍然被保留下來，故引起錯配的無效循環(huán)，最終引起細胞死亡，而MMR功能缺失時，鉑類藥物引起的DNA損傷就不能被識別和切除，細胞繼續(xù)存活，繼而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。但也有研究發(fā)現(xiàn)，MMR功能缺失的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺等化療藥物不耐藥[31]。綜上，MMR功能缺失的腫瘤細胞是否容易產(chǎn)生耐藥，可能因腫瘤細胞分子類型或藥物種類而異。這一問題，將可能成為腫瘤耐藥性研究的熱點。

4 MGMT基因

4.1 MGMT基因結構與功能

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)基因是一種DNA修復基因，定位于染色體 10q26，基因全長約 170 kb，由 5個外顯子以及 4個內(nèi)含子構成。該基因編碼的蛋白由207個氨基酸組成，是一種特殊的DNA損傷修復蛋白，通過將DNA分子中的O6-甲基鳥嘌呤上的甲基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上而達到修復DNA的目的。因此，MGMT蛋白可保護染色體免受烷化劑的致突變、致癌和細胞毒作用的損傷，而且有足夠證據(jù)表明該蛋白表達缺失時會顯著增加G-A突變頻率，尤其是K-RAS基因。

4.2 MGMT基因與腫瘤發(fā)生

研究發(fā)現(xiàn)，MGMT蛋白表達缺失可能與惡性膠質(zhì)瘤、食管癌、大腸癌等惡性腫瘤的形成有關[32-34]?，F(xiàn)已證實，基因缺失、突變、重排并不是MGMT蛋白表達缺失的主要原因，而MGMT基因啟動子CpG島超甲基化則是其編碼蛋白表達缺失的最主要機制。

Fritz G等[35]研究發(fā)現(xiàn)，烷化劑、吸煙、X射線等致DNA損傷的外源性因素能夠上調(diào)細胞內(nèi)MGMT蛋白表達。另有研究發(fā)現(xiàn)，MGMT蛋白在甲狀腺癌及大腸癌組織中的表達顯著高于癌旁黏膜[36-37]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織、大腸癌組織MGMT蛋白表達顯著高于癌旁組織，國內(nèi)呂金芳等的研究也得出了相似的結果[29,38-39]。這些研究結果提示，MGMT蛋白高表達可能是診斷腫瘤的一個參考指標。而這些結果與之前提到的MGMT蛋白表達缺失與腫瘤形成有關似乎有矛盾，當然這一矛盾可能是由于研究人群種族差異所致，然而，從不同的角度(原因及代償性結果)進行考慮也可以得到合理的解釋。同另幾種DNA修復蛋白一樣，MGMT蛋白表達的增高和降低亦都可以是腫瘤預警的標志。

4.3 MGMT基因與化療

烷化劑是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、淋巴瘤等很多惡性腫瘤的主要化療藥物，但其作用效果受腫瘤細胞DNA修復機能的影響。大量的臨床前體內(nèi)及體外實驗數(shù)據(jù)提示，這類藥物主要是通過促使DNA分子上O6-甲基鳥嘌呤形成殺死腫瘤細胞，而MGMT蛋白則通過對損傷部位的修復使腫瘤細胞對這類化療藥物耐藥。研究表明，細胞對烷化劑的敏感性與其MGMT活性負相關，MGMT功能缺陷的細胞對烷化劑引起的細胞毒作用或者致突變作用比較敏感。更值得注意的是，MGMT敲除鼠對烷化劑所引起的細胞毒作用比較敏感，而MGMT過表達鼠則對烷化劑耐藥[40]。Lin JW等[41]研究發(fā)現(xiàn)，MGMT 蛋白表達缺失與膠質(zhì)瘤患者烷化劑藥物治療敏感有關。由于啟動子甲基化常是MGMT表達降低的原因，所以MGMT啟動子甲基化狀態(tài)可能是預示腫瘤烷化劑化療成敗的一個因素，檢測其甲基化狀態(tài)有助于篩選能夠從烷化劑治療中受益的腫瘤患者。

5 展 望

DNA修復蛋白功能異常時細胞不能有效修復基因組的錯誤，致使錯誤不斷累積，最終發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，形成腫瘤。目前有關DNA修復功能異常與腫瘤發(fā)生關系的研究結果存在很大分歧。例如：在不同類型組織，ERCC1及XRCC1的基因多態(tài)性與腫瘤易感性并無明確相關性，MMR及MGMT蛋白表達異常與不同類型腫瘤發(fā)生的關系也無定論。值得注意的是MMR及MGMT蛋白表達缺失不僅與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，腫瘤細胞也常出現(xiàn)它們的高表達，甚至在癌旁組織也常出現(xiàn)它們的高表達。這提示盡管MMR及MGMT蛋白表達對具體腫瘤的診斷作用尚未明確，但它們表達的增高或降低都可能成為惡性腫瘤診斷的標志。這方面的相關研究將可能成為腫瘤臨床研究的熱點。

化療是大多數(shù)晚期腫瘤患者或者經(jīng)過手術切除但沒有得到完全根治患者的主要治療方法，該方法能夠在一定程度上延長腫瘤患者的生存時間，但較強的毒副作用及耐藥性產(chǎn)生使化療的臨床應用受到限制。如何為腫瘤患者篩選出最佳化療藥物已成為臨床亟待解決的問題。DNA修復功能異常不僅與腫瘤發(fā)生密切相關，也與腫瘤化療耐藥性產(chǎn)生密不可分。因此，檢測腫瘤細胞DNA修復蛋白表達對確定腫瘤患者的臨床用藥將有一定的指導作用，但如何指導某一特定腫瘤患者的個體化用藥尚需臨床醫(yī)生與基礎研究者的進一步共同艱苦努力，從而為腫瘤患者提供有的放矢的個體化治療，有效地減少化療藥物的毒副作用及耐藥性產(chǎn)生。

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