基于普魯士藍(lán)修飾二氧化硅球腔陣列的葡萄糖傳感器制備及應(yīng)用

孫磊，狄俊偉，尹凡，姚甜，沈菁，宗水珍

（1.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇蘇州 215123；2.江蘇省新型功能材料重點建設(shè)實驗室，江蘇常熟 215500；3.常熟理工學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

基于普魯士藍(lán)修飾二氧化硅球腔陣列的葡萄糖傳感器制備及應(yīng)用

孫磊1，3，狄俊偉1，尹凡2，姚甜3，沈菁3，宗水珍3

（1.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇蘇州 215123；2.江蘇省新型功能材料重點建設(shè)實驗室，江蘇常熟 215500；3.常熟理工學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

利用Langmuir-Blodgett技術(shù)和sol-gel法在氧化銦錫（ITO）電極上構(gòu)建二氧化硅（SiO2）球腔微電極陣列.在此球腔微電極陣列上電沉積普魯士藍(lán)膜（PB），用于過氧化氫檢測，并采用滴涂法將葡萄糖氧化酶（GOD）直接固定于PB/SiO2球腔微電極陣列上制得葡萄糖傳感器（酶電極），酶電極對葡萄糖電流響應(yīng)結(jié)果表明：葡萄糖濃度在4.7×10-6mol/L～3.8×10-3mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其檢出限為1.35×10-6mol/L，該酶電極不受抗壞血酸、尿酸等電活性物質(zhì)的干擾，穩(wěn)定性較好.

二氧化硅球腔；微電極陣列；普魯士藍(lán)；過氧化氫；葡萄糖傳感器

1 引言

糖尿病是全世界的三大高發(fā)病之一，目前患病人數(shù)已接近5000萬.是否患有糖尿病主要是根據(jù)病人血液中葡萄糖含量的水平來判斷的，如何快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地測試血液中葡萄糖濃度是研究的焦點.相對于其他測試血糖的方法，葡萄糖酶電極傳感器具有選擇性和靈敏度高，儀器裝置簡單、使用方便等優(yōu)點.酶傳感器是生物傳感器領(lǐng)域中研究最多、且最靈敏的一種類型.最早的生物傳感器就是葡萄糖酶生物傳感器[1].

由于微電極具有高傳質(zhì)速率、高電流密度、高信噪比、極小時間常數(shù)等優(yōu)點，可有效降低電化學(xué)檢測下限，已成為電化學(xué)研究的熱點.微電極陣列不僅保持了微電極的電化學(xué)特性，而且可有效放大響應(yīng)電流，可以在常規(guī)儀器上獲得滿意的電化學(xué)信號，因而受到越來越多的研究者關(guān)注.其中微/納米有序多孔球腔陣列不僅具有微電極的特點、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，其特有的網(wǎng)狀“蜂窩”結(jié)構(gòu)還具有顯著的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)[2]，被廣泛應(yīng)用在生物傳感器上.

普魯士藍(lán)是一種常見的六氰合鐵酸鹽，由于其對H2O2的高靈敏的電催化作用而在生物電化學(xué)領(lǐng)域受到關(guān)注，被稱為“人工過氧化物酶”.與天然酶相比較，其化學(xué)可逆性優(yōu)良、價格便宜、容易制備、穩(wěn)定性好、保存時間長、抗干擾與耐熱能力強.利用PB對H2O2獨特的電催化還原作用，與各種氧化酶結(jié)合，可以制成高靈敏度和高選擇性的生物傳感器.本文在氧化銦錫（ITO）電極上采用溶膠-凝膠法制備二氧化硅（SiO2）球腔微電極陣列，利用電沉積法制備普魯士藍(lán)二氧化硅膜（PB/SiO2）球腔陣列/ITO電極，并研究其對雙氧水（H2O2）的電催化性能，再固定葡萄糖氧化酶（GOD）來制備葡萄糖酶電極，研究其對葡萄糖的電催化性能.實驗結(jié)果表明，此修飾電極能夠很好地保持酶的電化學(xué)活性，并且對葡萄糖具有快速靈敏的電催化響應(yīng).

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Langmuir槽（612D型，英國NIMA），CHI660c電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），2xz-2型旋片式真空泵（上海儀表集團(tuán)供銷公司）；飽和甘汞電極為參比電極，鉑片（2×7 mm）電極為輔助電極，修飾的ITO電極陣列為工作電極；AL204電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；PHS-3C精密pH計（上海精密科學(xué)有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）.

將葡萄糖氧化酶（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）溶于pH7.0的PBS溶液中，配成3 mg/mL溶液.

0.06mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）由KH2PO4和K2HPO4按不同比例配制，磷酸二氫鉀（A.R.天津市大茂化學(xué)試劑廠），磷酸氫二鉀（A.R.天津市大茂化學(xué)試劑廠）.

0.2 mmol/L抗壞血酸、0.6 mmol/L尿酸、0.10 mol/L的葡萄糖、無水乙醇、丙酮、正硅酸乙酯（TEOS）、30% H2O2、NaOH、乙酸乙酯、氯化鉀、三氯化鐵、鐵氰化鉀均為分析純（A.R.），購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

ITO玻璃（100 Ω）購于蘇州板硝子電子有限公司；N2為鋼瓶裝普氮.實驗中所用水均為二次蒸餾水.

2.2 實驗方法

2.2.1 PS小球模板（PS/ITO）的制備

PS小球模板制備方法同文獻(xiàn)[3].

2.2.2 二氧化硅球腔陣列（SiO2/ITO）的制備

二氧化硅球腔陣列制備同文獻(xiàn)[4].

2.2.3 修飾電極的制備

2.2.3.1 PB修飾SiO2球腔微電極（PB/SiO2/ITO）的制備

將SiO2球腔陣列/ITO電極置于2.5 mmol/L FeCl3+2.5 mmol/L K3[Fe（CN）6]+0.1 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl的混合溶液中，于0.4 V（SCE）恒電位電沉積120 s，晾干得到PB/SiO2/ITO電極，未覆蓋球腔陣列的ITO電極表面涂覆石蠟，以避免裸露ITO電極對陣列電極電化學(xué)測試的影響.

2.2.3.2 酶電極（GOD/PB/SiO2/ITO）的制備

將3 mg GOD（葡萄糖氧化酶）溶于1 ml PBS（0.06 mol/L，pH7.0）溶液中，配成3 mg/mL GOD溶液，取20 μL GOD溶液直接滴加在PB/SiO2/ITO球腔陣列表面，密封保存，于4℃過夜，使其牢固吸附在電極表面.

2.2.4 電化學(xué)測試方法

在CHI660c電化學(xué)工作站上進(jìn)行測定.采用三電極電化學(xué)體系，以飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑片（2×7 mm）電極為輔助電極，PB/SiO2/ITO和GOD/PB/SiO2/ITO修飾電極分別為工作電極（0.5×0.4 cm）.運用控制電位電解庫侖法、循環(huán)伏安法、電流-時間曲線等方法進(jìn)行電化學(xué)測試.

3 結(jié)果與討論

3.1 PB/SiO2球腔陣列/ITO電極的電化學(xué)特性

從圖1可看出，SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L的PBS（pH7.0）溶液中沒有電化學(xué)響應(yīng)，PB/SiO2球腔陣列/ITO電極在此溶液中具有一對準(zhǔn)可逆的氧化-還原峰，氧化峰電位為0.086 V，還原峰電位為0.168 V，峰間距為82 mV，式量電位為0.127 V，這與文獻(xiàn)報道[5]的PB膜式量電位相似，表明其電化學(xué)響應(yīng)來自PB中的[Fe（CN）6]3-和[Fe（CN）6]4-，PB修飾在SiO2球腔陣列/ITO電極表面，且保持有較好的電化學(xué)響應(yīng).插圖是PB/ SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L PBS中不同掃描速率下的CV圖，說明隨著掃描速率的增大，氧化還原峰電流也隨之增加，峰電位略有移動，在40 mV/s～400 mV/s范圍內(nèi)，峰電流與掃速成正比，這表明電化學(xué)反應(yīng)為表面控制，證明PB膜已經(jīng)成功固定在球腔內(nèi)部[6].

3.2 PB/SiO2球腔陣列/ITO電極對H2O2的電催化

圖2是PB/SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L PBS（pH7.0）溶液中對H2O2的電催化效應(yīng)，當(dāng)在溶液中加入H2O2后，還原峰峰電流明顯增加，氧化峰峰電流略有減小，表明修飾在SiO2球腔微電極陣列表面的PB對H2O2的還原具有明顯的電催化響應(yīng)，可以作為H2O2的電化學(xué)傳感器.

3.3 GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極（葡萄糖傳感器）電化學(xué)特性

如圖3所示，GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L的PBS（pH7.0）溶液中加入葡萄糖后的電催化效應(yīng).當(dāng)在溶液中加入葡萄糖后，還原峰峰電流明顯增加，氧化峰峰電流略有減小，表現(xiàn)出明顯的電催化行為.這表明GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO修飾電極在加入葡萄糖后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2與PB發(fā)生了電化學(xué)響應(yīng)，因此可以作為檢測葡萄糖濃度的電化學(xué)傳感器[7].

圖1 PB/SiO2球腔陣列/ITO、SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L PBS（pH7.0掃描速率為100 mV/s）的CV曲線

圖2 PB/SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L PBS（pH7.0）溶液中加入不同濃度H2O2的CV圖（掃描速率100 mV/s）

圖3 GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極在0.06 mol/L PBS（pH7.0）溶液中連續(xù)加入0.2 mmol/L的葡萄糖的CV圖（掃描速率100 mV/s）

3.4 葡萄糖傳感器工作條件的優(yōu)化

從圖4可以看出在不同的pH值下GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO修飾電極電化學(xué)活性強弱的變化.GOD/ PB/SiO2球腔陣列/ITO修飾電極在pH值為5.0時，峰電流降至pH值6.0時的92%；當(dāng)pH值為7.0時，峰電流降低至pH值6.0時的95%；當(dāng)pH值為8.0時，峰電流降低至pH值6.0時的65%，pH值為9.0時，峰電流逐漸減小，直到消失最小.PB膜通常在酸性條件下比較穩(wěn)定，在中性和弱堿性條件下會發(fā)生溶解.在這個實驗中，PB膜固定在SiO2球腔內(nèi)部，SiO2球腔表面存在的一些羥基對PB膜存在保護(hù)作用，酶覆蓋在PB膜的表面，進(jìn)一步保護(hù)了PB膜，所以電極在中性條件下穩(wěn)定性仍然較高，而隨著pH值的增大，進(jìn)入堿性環(huán)境，PB膜逐漸溶解，電流響應(yīng)有所改小，電化學(xué)活性相應(yīng)有所減弱.

3.5 葡萄糖傳感器的響應(yīng)性能

圖5是連續(xù)加入等濃度的葡萄糖時GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極電流響應(yīng)曲線.插圖是濃度與電流的線性校正曲線.由圖知，加入葡萄糖后響應(yīng)電流隨即增大，約在6 s內(nèi)達(dá)到平衡，說明該電極對加入的葡萄糖響應(yīng)快速.從圖5中分析得到葡萄糖濃度在4.7×10-6mol/L～3.8× 10-3mol/L內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ipa（μA）=-0.00839+0.5856C（mmol/L），R=0.998，其檢出限為1.35×10-6mol/L（S/N=3）.以此方法制備的GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極對葡萄糖響應(yīng)迅速，反應(yīng)靈敏，具有較低的檢測下限.這說明由于二氧化硅特有的球腔結(jié)構(gòu)，使雙氧水不容易向遠(yuǎn)處擴(kuò)散，電極附近雙氧水濃度較高；另外二氧化硅的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，使反應(yīng)的比表面積增大，增加了葡萄糖氧化酶的吸附量，從而降低了檢測下限.

3.6 GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

將GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極置于0.06 mol/L PBS（pH7.0）緩沖溶液中，選擇掃描速率為100 mV/s，連續(xù)100圈CV掃描，考察該電極的穩(wěn)定性.結(jié)果表明：經(jīng)過100次掃描后的CV圖中峰電位、峰間距幾乎沒有變化，峰電流下降12.3%，表明該電極穩(wěn)定性較好.對所制備的5支電極對1 mmol/L的葡萄糖響應(yīng)的RSD 為3.8%，表明重現(xiàn)性實驗結(jié)果也較好.將該電極置于常溫中放置7天后使用，響應(yīng)電流為初始的95.0%，說明該電極穩(wěn)定性較好，具有較長的使用壽命.由于溶膠-凝膠的化學(xué)過程在溫和條件下進(jìn)行，pH值近于中性，處理溫度低，因此既提高了電極中酶被固定化的效果，又維持了酶的活性，此外，溶膠-凝膠技術(shù)的修飾使傳感器中酶不易滲漏流失，提高了長期儲存的穩(wěn)定性.

3.7 GOD/PB/SiO2球腔陣列/ITO電極選擇性能試驗

由于本實驗選用低的測定電位，因此大大提高了酶電極的選擇性.當(dāng)在1 mmol/L的葡萄糖溶液中測得穩(wěn)定的響應(yīng)電流后，再加入0.6 mmol/L尿酸，200 s后再加0.2 mmol/L抗壞血酸，響應(yīng)電流幾乎不變.這一實驗結(jié)果表明：該酶電極能很好地消除這些活性物質(zhì)的干擾，選擇性能較好.

圖4 pH值對傳感器響應(yīng)的影響

4 結(jié)論

本文采用簡單易行的方法制備了一種葡萄糖傳感器，由于普魯士藍(lán)具有穩(wěn)定性高、電化學(xué)可逆性好、價格低廉、容易制備等特點，而SiO2球腔的半包含性和其特殊的“蜂窩”結(jié)構(gòu)使普魯士藍(lán)能夠更多的負(fù)載在電極上并保持較好的生物活性.實驗證明，該傳感器對葡萄糖檢測具有檢測下限低、選擇性高和穩(wěn)定性好的特點，同時還具備響應(yīng)速度快、制作簡單等優(yōu)點，因此，該傳感器具有較好的實用性，是一種很有應(yīng)用前景的葡萄糖電化學(xué)傳感器.

[1]Sha Xian-zheng,Gough DA.Simulation of an implantable enzyme-based glucose sensor[J].Chinese Journal of Biom edical Engineering,2004,23(3):236-242,258.

[2]Holland T B,Blanford C F,Do T.Syntesis of highly ordered,three-dimensional,macroporous structures of amorps or crystalline inorganic oxides,phosphates,and hybrid composites[J].Chem Mater,1999,11(2):795-805.

[3]池曉雷，陸婷，汪學(xué)英，等.微電極的制備及電化學(xué)性質(zhì)研究[J].常熟理工學(xué)院學(xué)報，2010，24（2）：52-55.

[4]周麗娟，尹凡，周宇.基于二氧化硅球腔微電極陣列的過氧化氫生物傳感器制備[J].分析化學(xué)，2011，39（9）：1313-1317.

[5]付萍，袁若，柴雅琴.基于殼聚糖-納米金／納米普魯士藍(lán)／L-半胱氨酸修飾的葡萄糖傳感器的研究[J].化學(xué)學(xué)報，2008，66 （15）：1796-1802.

[6]李彤，姚子華.普魯士藍(lán)修飾電極結(jié)合硅溶膠-凝膠技術(shù)制備高靈敏葡萄糖傳感器[J].分析化學(xué)，2004，32（2）：230-237.

[7]陳昌國，董海峰，盧惠婷.普魯士藍(lán)修飾碳糊電極測定過氧化氫的研究[J].分析科學(xué)學(xué)報，2009，25（2）：232-234.

Fabrication and Application of Glucose Sensor Based on Prussian Blue Modified Silicon Dioxide Cavities Array

SUN Lei1,3,DI Jun-Wei1,YIN Fan2,YAO Tian3,SHEN Qing3,ZONG Shui-Zhen3
(1.Colllege of Chemistry,Chemical Engineering and Materials Science of Soochow University,Suzhou 215123,China; 2.Jiangsu Laboratory of Advanced Functional Materials,Changshu 215500,China; 3.School of Chemistry and Material Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

The silicon dioxide(SiO2)cavities microelectrode array was fabricated on the indium tin oxide(ITO) electrode,which was constructed by the Langmuir-Blodgett(LB)technology and sol-gel technology.The Prussian Blue(PB)film was fabricated on the SiO2cavities array by electrodeposition technique,which was used to construct electrochemical sensor for the detection of hydrogen dioxide(H2O2).A glucose biosensor was obtained by drop-coating glucose oxidase(GOD)in PB/SiO2cavities array/ITO electrode directly.The resulting biosensor was highly sensitive to glucose with a linear calibration plot in the concentration range of 4.7×10-6-3.8×10-3mol/L glucose,the detection limit 1.35×10-6mol/L glucose(S/N=3).It is free of interference by ascorbic acid,uric acid and other active substances.and also have good stability.

silicon dioxide cavities;microelectrode array;Prussian blue;hydrogen dioxide;glucose sensor

O657

A

1008-2794（2012）10-0060-05

2012-09-01

孫磊（1977—），男，浙江紹興人，實驗師，蘇州大學(xué)碩士研究生，研究方向：電化學(xué)．