美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)條件的研究

徐蟬，張敬澤，王曉清，王志丹，郭得平

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州，310058）

美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)條件的研究

徐蟬，張敬澤，王曉清，王志丹，郭得平

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州，310058）

研究了疏親水界面、溫度、pH值和不同物質(zhì)對(duì)美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)的影響，以探討美味黑粉菌冬孢子在自然生境條件萌發(fā)的適應(yīng)性。研究結(jié)果表明，疏水界面促進(jìn)美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)，在疏水的聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿和茭白莖表皮上，萌發(fā)率高；冬孢子萌發(fā)的最適溫度為27～30℃，溫度過(guò)高或過(guò)低均抑制萌發(fā)；酸性條件促進(jìn)冬孢子萌發(fā)，最適pH值為3～4；蔗糖促進(jìn)冬孢子萌發(fā)，且以1%濃度最適，但同樣濃度的甘露醇、葡萄糖、海藻糖、D-果糖等抑制冬孢子萌發(fā)。

美味黑粉菌；冬孢子；萌發(fā)率

美味黑粉菌（Ustilago esculenta）是黑粉菌目、黑粉菌科、黑粉菌屬真菌，原發(fā)生于我國(guó)，在我國(guó)臺(tái)灣、越南、日本等東南亞國(guó)家和地區(qū)有分布。美味黑粉菌能侵染茭白（Zizania latifolia）并誘導(dǎo)其莖膨大，茭白以其膨大莖供食，是我國(guó)重要的水生蔬菜。通常，美味黑粉菌在茭白組織中以菌絲體的形式存在，但有時(shí)其會(huì)產(chǎn)生大量的冬孢子[1]。

大量試驗(yàn)表明，美味黑粉菌在寄主植物茭白體內(nèi)以菌絲體形式完成整個(gè)生活史。冬孢子作為接種源，其作用還未被試驗(yàn)證實(shí)[2]。而依據(jù)黑粉菌屬特性，幾乎所有黑粉菌都具有二態(tài)型，冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體的擔(dān)孢子，擔(dān)孢子像腐生的酵母一樣生長(zhǎng)但對(duì)寄主沒(méi)有侵入性。當(dāng)2個(gè)單倍體細(xì)胞融合后，產(chǎn)生的雙核絲狀體能侵染寄主植物，導(dǎo)致黑粉病的發(fā)生[3，4]。研究美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)特性，是了解其生活史和侵染機(jī)制的基礎(chǔ)。前人對(duì)菰黑粉菌冬孢子的萌發(fā)情況進(jìn)行了觀察和研究[5~7]，但冬孢子萌發(fā)對(duì)自然生境的確切需求還不很明了，因此，本文通過(guò)模擬影響冬孢子萌發(fā)的因素，進(jìn)一步探討美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)環(huán)境條件的要求，為研究冬孢子在真菌生活史中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 真菌材料

美味黑粉菌成熟冬孢子取自2010年浙江省德清縣梭子茭品種的灰茭植株上?；臆嬖谑覂?nèi)半年后，取中部的冬孢子制備孢子懸浮液。

1.2 試驗(yàn)方法

①孢子懸浮液的配制 取灰茭橫切面中部少量孢子，接于含有滅菌水的1.5 mL Eppendorf離心管中，振蕩混勻，配制每1 mL含1×106個(gè)孢子的懸浮液。

②疏親水界面對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 用移液槍取孢子懸浮液，分別接入聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿（直徑6 cm）、滅菌載玻片、含有水瓊脂培養(yǎng)基的表面和茭白莖皮條表面，標(biāo)記接菌點(diǎn)位。每培養(yǎng)皿、載玻片、水瓊脂培養(yǎng)基和茭白莖皮條表面都含有3個(gè)孢子懸浮液液滴，然后放置到含有2層濕潤(rùn)濾紙的密封容器中，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。48 h后鏡檢，觀察記錄冬孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率（%）=[孢子萌發(fā)數(shù)/（孢子萌發(fā)數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù)）]×100%。

③不同溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 用移液槍取孢子懸浮液，接種于聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個(gè)孢子懸浮液液滴。分別置于15，18，21，24，27，30，33，36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。44 h后鏡檢，觀察和統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)率。

④不同pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 制備pH值為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11的冬孢子懸浮液（濃度為1×106個(gè)/mL孢子），接種于聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個(gè)孢子懸浮液液滴。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。36 h后鏡檢，觀察和統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

⑤不同營(yíng)養(yǎng)物對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 制備冬孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL孢子），其中懸浮液分別含有蔗糖（1%）、甘露醇（1%）、氯化鈉（1%）、葡萄糖（1%）、海藻糖（1%）和D-果糖（1%）。將所有冬孢子懸浮液的pH值調(diào)為4，接種于聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個(gè)孢子懸浮液液滴。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。18 h后鏡檢，觀察和統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

⑥蔗糖濃度對(duì)孢子萌發(fā)的影響 制備冬孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL孢子），使其蔗糖濃度分別為0.0%，0.1%，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%。將所有冬孢子懸浮液的pH值調(diào)為4，接種于聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿（直徑6 cm）中，每皿含有3個(gè)孢子懸浮液液滴，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后鏡檢，觀察和統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 疏親水界面對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

表1結(jié)果顯示，冬孢子在茭白莖皮條表面萌發(fā)率最高，約為32%，其次是在聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿，約為31%，但兩者沒(méi)有顯著差異（P<0.05）；再次是在載玻片，約為17%，在水瓊脂表面最低，僅為4%。結(jié)果表明，冬孢子在不同疏親水界面上萌發(fā)率差異是顯著的，揭示了冬孢子萌發(fā)受接觸硬度和疏親水界面的誘導(dǎo)。

2.2 不同溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

表2結(jié)果顯示，美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)溫度范圍在15~33℃，但低溫和高溫影響冬孢子萌發(fā)率。低于21℃，各處理間冬孢子萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異（P< 0.05）；但高于21℃后，不同溫度間差異顯著；當(dāng)溫度達(dá)到36℃時(shí)沒(méi)有孢子萌發(fā)。美味黑粉菌冬孢子最適萌發(fā)溫度為28℃左右。

2.3 不同pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖1結(jié)果顯示，冬孢子在較大的pH值范圍內(nèi)都能萌發(fā)，酸堿都能影響冬孢子萌發(fā)率，但酸性條件更顯著。但當(dāng)pH值在7左右時(shí)，冬孢子幾乎不萌發(fā)，因而，冬孢子萌發(fā)率呈現(xiàn)雙峰。當(dāng)pH值在1~7范圍內(nèi)，冬孢子萌發(fā)率呈正態(tài)分布，當(dāng)pH值在3左右時(shí)，冬孢子萌發(fā)率達(dá)到最高，約為95%。

表1 不同培養(yǎng)界面對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

表2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖1 不同pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

2.4 不同營(yíng)養(yǎng)物對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

表3結(jié)果顯示，不同物質(zhì)對(duì)黑粉菌冬孢子萌發(fā)影響較大，蔗糖能顯著的促進(jìn)冬孢子萌發(fā)，而經(jīng)甘露醇、氯化鈉、葡萄糖、海藻糖和D-果糖處理的冬孢子萌發(fā)率均顯著低于對(duì)照，對(duì)孢子萌發(fā)有顯著抑制作用。其中，D-果糖抑制效果最顯著，其次是海藻糖和葡萄糖，兩者之間沒(méi)有顯著差異；最后是氯化鈉和甘露醇，兩者之間沒(méi)有顯著差異。

2.5 蔗糖濃度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖2結(jié)果顯示，冬孢子在蔗糖濃度為0%~5.0%時(shí)均可萌發(fā)，蔗糖顯著地促進(jìn)冬孢子萌發(fā)，且當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到1.0%時(shí)，冬孢子萌發(fā)率最高，顯著高于其他處理濃度（P<0.05）。同時(shí)，結(jié)果也顯示，低濃度和高濃度的蔗糖溶液能抑制冬孢子萌發(fā)。

3 結(jié)論與討論

孢子萌發(fā)標(biāo)志著真菌從休眠狀態(tài)到活性發(fā)育的轉(zhuǎn)變，其在真菌生活史中是一個(gè)關(guān)鍵階段。真菌已經(jīng)演化出了確保孢子對(duì)專門(mén)適合生長(zhǎng)條件信號(hào)反應(yīng)的機(jī)制。在大多數(shù)情況下，糖是真菌孢子萌發(fā)所必須的，應(yīng)保證其需要[8]。除此之外，植物基質(zhì)或信號(hào)也誘導(dǎo)其萌發(fā)，如固體疏水表面或表皮蠟質(zhì)[9]，而且孢子依據(jù)激活信號(hào)演化出不同萌發(fā)類型[10，11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，美味黑粉菌冬孢子在疏水和硬的聚苯乙烯塑料和茭白莖表皮表面具有較高的萌發(fā)率，在較親水和硬的載玻片上萌發(fā)率較低，而在親水和軟的水瓊脂培養(yǎng)基表面上萌發(fā)率最低。這些結(jié)果證明美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)受疏水性和硬的表面的誘導(dǎo)，也表明黑粉菌冬孢子傾向于在靠近茭白植株根莖部表皮處萌發(fā)生長(zhǎng)，這可能利于黑粉菌對(duì)茭白植株的侵染。有些真菌孢子萌發(fā)需要宿主的存在[12]，但美味黑粉菌冬孢子在塑料培養(yǎng)皿和玻璃板上都能直接萌發(fā)。

本試驗(yàn)中，美味黑粉菌冬孢子在溫度為27~ 30℃時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最高，與以前報(bào)道相似[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)溫度稍高于一般真菌孢子25℃左右的萌發(fā)適溫。pH值對(duì)美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)的影響較大，在本試驗(yàn)?zāi)７碌淖匀簧硹l件下，冬孢子萌發(fā)的最適pH值為3~4，但當(dāng)pH值降低到2時(shí)，能明顯觀察到其芽管呈短縮狀，甚至其后產(chǎn)生的擔(dān)孢子也為短縮狀，可見(jiàn)pH值太低不利于孢子生長(zhǎng)；而在pH為中性時(shí)，冬孢子幾乎未萌發(fā)，與前人報(bào)道的美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)的最適pH值為6[5，6]、玉米絲黑穂病病原菌冬孢子萌發(fā)最適pH值為7的研究結(jié)果有很大差異[12]，其原因可能是pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響與萌發(fā)基質(zhì)有關(guān)，以前研究所用基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基[5，6]，而本試驗(yàn)所用萌發(fā)基質(zhì)為水。

蔗糖、葡萄糖、甘露醇等碳源有利于冬孢子萌發(fā)[13]，也有報(bào)道認(rèn)為生理鹽水也可促進(jìn)孢子萌發(fā)[14]，其中葡萄糖常被用作促進(jìn)多種真菌孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)液[15]。但我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示，甘露醇、葡萄糖、海藻糖、D-果糖和氯化鈉對(duì)美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)有一定的抑制作用，而1.0%的蔗糖溶液對(duì)美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)卻有顯著促進(jìn)作用，是冬孢子發(fā)育最有效的糖[2，5，6]。這可能與寄主協(xié)同進(jìn)化密切相關(guān)，在寄主體內(nèi)，葉片產(chǎn)生的糖主要以蔗糖的形式從葉片向其他組織運(yùn)輸，寄主體內(nèi)的真菌菌絲獲得的營(yíng)養(yǎng)可能主要是蔗糖。因此，本研究結(jié)果為了解美味黑粉菌冬孢子在田間自然環(huán)境條件下的行為和作用提供了重要信息。

表3 不同刺激物對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖2 蔗糖濃度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

[1]Zhang J Z,Chu F Q,Guo D P,et al.Cytology and ultrastructure of interactions betweenUstilago esculentaandZizania latifolia[J].Mycol Prog,2012,11(2):499-508.

[2]Chung K R,Tzeng D D.Nutritional requirements of the edible gall-producing fungusUstilago esculenta[J].J Biol Sci,2004,4(2):246-252.

[3]Brefort T,Doehlemann G,Mendoza-Mendoza A,et al.Ustilago maydisas a pathogen [J].Annu Rev Phytopathol, 2009,47:423-425.

[4]K?mper J,Kahmann R,B?lker M,et al.Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogenUstilago maydis[J].Nature,2006,444:97-101.

[5]程巖，沈崇堯，裘維蕃.關(guān)于茭白黑粉菌的正名問(wèn)題[J].真菌學(xué)報(bào)，1989，8（1）：9-16.

[6]郭得平，李曙軒，曹小芝.茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）某些生物學(xué)特性[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，17（1）：80-84.

[7]李志蘭，尤文雨，鄒克琴，等.菰黑粉菌冬孢子萌發(fā)過(guò)程形態(tài)學(xué)觀察及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].中國(guó)計(jì)量學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，21（2）：140-145.

[8]Osherov N,Gregory S M.The molecular mechanisms of conidial germination [J].FEMS Microbiol Lett,2001,199 (2):153-160.

[9]Chaky J,Anderson K,Moss M,et al. Surface hydrophobicity and surface rigidity induce spore germination inColletotrichumgraminicola[J]. Phytopathology,2001,91:558-564.

[10]Barhoom S,Sharon A.cAMP regulation of"pathogenic" and"saprophytic"fungal spore germination [J].Fungal Genet Biol,2004,41(3):317-326.

[11]Doehlemann G,Berndt P,Hahn M.Different signalling pathways involving a Galpha protein,cAMP and a MAP kinase control germination ofBotrytis cinereaconidia[J]. Mol Microbiol,2006,59(3):821-835.

[12]吳景芝，魏永田，李自萍，等.玉米絲黑穗病菌冬孢子萌發(fā)濕度及云南玉米新品種抗性鑒定研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（19）：186-189.

[13]吳偉懷，謝祖健，賀春萍，等.甘蔗黑穗病菌冬孢子生物學(xué)特性及殺菌劑對(duì)其萌發(fā)的影響 [J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2009，30（11）：1 674-1 678.

[14]農(nóng)業(yè)部.食用菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)匯編[M].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[15]俞大紱.植物病理學(xué)和真菌技術(shù)匯編[M].北京：人民教育出版社，1977.

Research on Factors Influencing Teliospore Germination ofUstilago esculenta

XU Chan,ZHANG Jingze,WANG Xiaoqing,WANG Zhidan,GUO Deping
(College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058)

We investigated the factors influencing teliospore germination ofUstilago esculenta,such as surface characters, temperature,pH value and stimulants.The results showed that hydrophobic surfaces promoted the germination of teliospore,and the germination rates were higher on the hydrophobic polyethylene Petri dishes and surfaces of stem epidermis ofZizania latifolia.The highest germination rate occurred at 27 to 30℃,whereas it was inhibited by higher or lower temperature.The acidic condition promoted the germination of teliospore,with the optimum pH value of 3 to 4,and sucrose with the concentration of 1%was best fit for the germination of teliospore,but other carbon sources,such as mannitol,glucose,trehalose,D-fructose,inhibited teliospore germination.

Ustilago esculenta;Teliospore;Germination rate

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.038

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“水生蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研究與示范”（編號(hào)200903017-03）徐蟬（1986-），女，碩士，主要從事園藝學(xué)研究，電話：0571-88982796，E-mail：xchan8808@163.com郭得平，通信作者，E-mail：dpguo@zju.edu.cn

2012-06-28