家蠶綿繭突變性狀調(diào)查

劉春 朱曉楠 劉茹鳳 任靜波 石虎 荀立杰 夏慶友

（家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716）

家蠶（Bombyx mori）具有吐絲結(jié)繭的行為，對正在變態(tài)發(fā)育的蠶蛹進(jìn)行保護并防御外來侵害[1]。家蠶在馴養(yǎng)進(jìn)化過程中出現(xiàn)大量的突變品種，其中在記錄的超過400種，性狀分布在家蠶發(fā)育的各個時期。從20世紀(jì)初，科學(xué)家們便開始利用突變品系對家蠶進(jìn)行經(jīng)典遺傳學(xué)研究，取得成果頗豐，為家蠶研究打下堅實基礎(chǔ)[2]。

隨著家蠶基因組的破譯，家蠶基因組學(xué)迅速發(fā)展，各種分子標(biāo)記建立高密度分子連鎖圖譜、家蠶多樣性指紋圖譜以及以克隆為基礎(chǔ)的物理圖譜[3]相繼出現(xiàn)。利用分子標(biāo)記技術(shù)可對影響家蠶生長率、產(chǎn)量、繭絲質(zhì)量以及抗病性的基因進(jìn)行打靶，遺傳上快速重組遺傳物質(zhì)建立新的品種，令蠶業(yè)經(jīng)濟保持可持續(xù)發(fā)展[3]。

近些年，家蠶定位克隆研究發(fā)展迅速，oq油蠶、伴性赤蟻、暗化型、綠繭等突變基因先后被報道定位。各種分子代謝機制也紛紛被解密。

絲腺為家蠶幼蟲體內(nèi)最大的器官，是合成和分泌絹絲的外分泌腺。蠶絲是由兩根并行單纖維構(gòu)成。一般繭絲中絲素占70%～80%，絲膠占20%～30%。

蠶繭主要由繭衣、繭層、蛹衣、蛹體和蛻皮構(gòu)成。對蠶繭性狀的描述，主要有繭形、繭色、全繭量、繭層率等。另外，繭層率因品種、時期、雌雄、化蛹程度、繭型大小、飼育方法環(huán)境等不同而呈現(xiàn)差異。此外，衡量蠶繭的經(jīng)濟性狀指標(biāo)還有：繭絲長和繭絲重、解舒絲長和解舒率、出絲率、繭絲纖度等[4]。

家蠶綿繭突變（Flossy，F(xiàn)l，系統(tǒng)編號：02－220），為自然突變品系，因繭層浮松，繭外形寬大且不規(guī)則而得名，由Banno[5]等人于2001年報道。綿繭突變系單基因突變，遵循孟德爾經(jīng)典遺傳規(guī)律，其經(jīng)典連鎖位點是第7連鎖群的32.1[1]。綿繭突變是家蠶少數(shù)有關(guān)繭絲形成和營繭行為相關(guān)的突變之一，對研究繭絲品質(zhì)形成和家蠶營繭行為有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

夏芳、大造、綿繭品種蠶繭，由西南大學(xué)家蠶基因庫提供。2009年春季于西南大學(xué)蠶學(xué)與生物系統(tǒng)研究所蠶房按常規(guī)方法飼養(yǎng)夏芳、大造、綿繭品種，上蔟采繭后隨機抽樣取繭若干做實驗材料。

1.2 不同發(fā)育時期觀察

綿繭和大造不同時期的形態(tài)觀察比較：對所調(diào)查品種的蟻蠶，成蟲、絲腺直接進(jìn)行肉眼和顯微鏡形態(tài)觀察。

1.3 繭層率的測量

繭層率的測量方法參考（絲綢學(xué)院絲綢教研組.繭絲學(xué)實驗指導(dǎo)），具體方法如下：隨機抽取各品種蠶繭30粒，10粒一組，剝?nèi)ダO衣，削繭，去蛹，標(biāo)記。按常規(guī)方法稱量全繭量、蛹重。將繭放入烘箱內(nèi)烘至無水恒重（前后稱量差不超過0.001g），稱其無水干量（標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)20℃RH60%～65%下稱重）[6]。計算繭層率：

1.4 含膠率的測量

含膠率的測量方法參考（絲綢學(xué)院絲綢教研組.繭絲學(xué)實驗指導(dǎo)），具體方法如下：取各品種蠶繭繭層5.00g，在浴比1∶100的中性皂溶液中煮沸進(jìn)行脫膠，時間約1h，中間更換中性皂溶液一次。后期使用0.83%的碳酸鈉溶液、微醋酸水溶液、單蒸水處理洗滌脫膠后的絲素。用胭脂紅苦味酸法檢驗絲膠是否脫盡。最后于烘箱內(nèi)將絲素烘至無水恒重（前后稱量差不超過0.001g），稱量[6]。做3次重復(fù)。

1.5 繭絲顯微鏡觀察

繭絲顯微鏡觀察的方法參考（絲綢學(xué)院絲綢教研組.繭絲學(xué)實驗指導(dǎo)），具體方法如下：各取夏芳、大造、Fl蠶繭1粒，將蠶繭分為內(nèi)層、中層、外層；每層剪取小塊繭絲，置于載玻片上，使用2%NaOH溶液對繭絲進(jìn)行脫膠處理，然后單蒸水洗凈，做成裝片，進(jìn)行顯微鏡觀察，放大倍數(shù)為4×10[6]。

1.6 繭絲絲膠蛋白SDS－PAGE

繭絲顯微鏡觀察的方法參考榮海博碩士畢業(yè)論文，具體方法如下：各品種蠶繭，剪碎后，定量為0.10g，使用1×PBS溶解提取絲膠蛋白質(zhì)，上樣電泳[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿繭的形態(tài)觀察

2.1.1 不同品種蠶繭形態(tài)觀察

于常規(guī)條件下飼養(yǎng)夏芳、大造、Nd、綿繭蠶品種，將各品種采集的蠶繭分類放置于通風(fēng)干燥環(huán)境下。蠶繭拍照結(jié)果如圖1所示，圖中可見綿繭繭衣與繭層之間界限不明顯，蠶繭表現(xiàn)多層且浮松，形狀不規(guī)則；大造和夏芳品種繭層緊實，大造繭形呈紡錘形，夏芳則呈橢圓形；蠶繭大小上，綿繭體型較大，接近于夏芳。綿繭蛹體型大小接近于大造蛹體。

圖1 家蠶不同品種蠶繭比較

2.1.2 不同蠶品種絲腺觀察比較

我們對在相同條件下飼養(yǎng)的大造、綿繭和夏芳品種，于5齡第三天時隨機抽取三個品種蠶，并解剖取出絲腺進(jìn)行觀察比較，拍照結(jié)果如圖2所示。圖中比較發(fā)現(xiàn)，解剖大造、綿繭和夏芳5齡第三天幼蟲，三者絲腺之間不存在明顯差異，彎折基本一致，夏芳整個絲腺偏大，大造的絲腺偏小，而綿繭的居中。

圖2 大造、綿繭和夏芳5齡第3天絲腺比較

2.2 不同品種蠶繭繭層率和含膠率調(diào)查

我們對夏芳、大造、綿繭品種的蠶繭的繭絲性狀進(jìn)行調(diào)查，主要對全繭量、繭層率以及蠶繭含膠率進(jìn)行了調(diào)查，每個品種隨機抽取蠶繭10粒，進(jìn)行全繭量、繭層量、繭層率調(diào)查記錄，共重復(fù)三次，結(jié)果如表1所示。

調(diào)查結(jié)果顯示，夏芳、綿繭、大造繭層率分別為：23.476%、15.551%、12.919%，品種間繭層率為下降趨勢；含膠率調(diào)查中，三個品種的含膠率分別為：27.182%、29.608%、34.767%，品種間含膠率為上升趨勢。綿繭蛹體重與大造蛹體基本一致。綜合看來，三個品種繭層率和含膠率之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，我們將結(jié)果整理，如圖3所示。圖中可看出，三個品種間，隨著繭層率的下降，對應(yīng)含膠率則呈上升趨勢。這里值得注意的是，在綿繭繭層量比大造品種高的情況下，兩個品種的蛹體重基本一致。

表1 不同品種蠶繭繭絲性狀調(diào)查

圖3 不同品種蠶繭性狀調(diào)查

2.3 繭絲顯微鏡觀察

比較夏芳、大造、綿繭的內(nèi)中外層繭層，各品種的繭層用2%NaOH溶液脫膠后，顯微鏡拍照如圖4所示。結(jié)果顯示，同品種不同繭層之間未發(fā)現(xiàn)明顯差異；綿繭同其他品種相比，不同品種相同繭層之間沒有明顯差異。由于繭絲脫膠的原因，因而不排除含絲膠的繭絲存在差異。

2.4 不同品種蠶繭絲膠蛋白電泳

為了比較夏芳、大造、綿繭繭層絲膠蛋白的成分差異，將1×PBS提取的絲膠蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，結(jié)果如5所示。圖中可以看出，綿繭絲膠蛋白和夏芳、大造相比，成分上沒有明顯差異。圖中可看出，在25KD左右處，各個品種都有一條較為明顯的蛋白帶，該蛋白是絲素蛋白P25或fib－L蛋白或其它蛋白還有待進(jìn)一步鑒定。

3 討論

綿繭突變體在研究和生產(chǎn)上具有很大應(yīng)用價值，其不僅具有揭露繭絲形成機理的潛力，而且綿繭更適合被應(yīng)用于蠶絲被的生產(chǎn)。遺傳上，綿繭屬于單基因突變，遵循經(jīng)典遺傳定律，表型上，綿繭繭層浮松，多分層。通過對綿繭繭層率、含膠率和絲膠蛋白成分分析，希望能找出其繭層浮松的原因，為繭絲形成機理和綿繭定位克隆研究提供線索。

圖4 不同品種外中內(nèi)繭層的繭絲比較

圖5 不同品種蠶繭絲膠蛋白電泳

綿繭的形成機制一直是個謎題，綿繭突變體在發(fā)育、體形、生理上與野生型相比均沒有明顯差異，致使繭層浮松和多層的原因一直未知。日本方面也對綿繭突變體幼蟲的吐絲行為進(jìn)行了觀察研究，同樣未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。本文從繭層率、含膠率和蛋白質(zhì)水平尋找綿繭與野生型個體的不同，但從繭層率、含膠率和蛋白質(zhì)電泳結(jié)果來看，與正常個體相比，綿繭并未表現(xiàn)出明顯的差異。這也意味著綿繭形成的原因仍是一個未知的謎題。而就目前的實驗結(jié)果看來：其一，綿繭的絲膠蛋白的含量也許是個突破口。而絲膠是繭絲之間膠著的介質(zhì)，綿繭形成和絲膠蛋白有著十分密切的關(guān)系；其二，在綿繭繭層量比大造品種高的情況下，綿繭蛹體重卻與大造蛹體基本一致。由于不知綿繭與大造熟蠶體重，故而無法比較得出結(jié)果，是否存在綿繭體內(nèi)含水量較高的可能性需要進(jìn)一步實驗驗證。因而，下一步實驗將會圍繞尋找綿繭絲膠蛋白差異和調(diào)查綿繭吐絲過程中脫水量展開。

在目前的家蠶養(yǎng)殖生產(chǎn)中，家蠶上蔟時多濕的環(huán)境會造成綿繭發(fā)生概率增大。蠶繭性狀是由多基因控制，而綿繭突變體屬單基因顯性突變，即由于單基因突變致使綿繭持續(xù)穩(wěn)定發(fā)生。因而筆者推斷，突變體有可能是自身原因造成蠶繭內(nèi)環(huán)境形成一個多濕的環(huán)境，從而造成綿繭形成，這個問題有待于進(jìn)一步的實驗驗證。

[1]向忠懷.蠶絲生物學(xué)[M].北京：中國林業(yè)出版社，2005.

[2]向仲懷.家蠶遺傳育種學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[3]Nagaraju，J.，Goldsmith，M.R.，Silkworm genomics－progress and prospects[J].Current Science，2002，83（4）：451－425.

[4]黃國瑞.繭絲學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[5]Banno Y，Hujii H，Doira H.Inheritance of one cocoon shape mutant named“Floossy cocoon”of the silkworm，Bombyx mori[J].Journal of Insect Biotechnology and Sericology，2001，70：189.

[6]絲綢學(xué)院絲綢教研組.繭絲學(xué)實驗指導(dǎo)[M].重慶，2001.9

[7]榮海博.家蠶絲腺特異表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的克隆及蛋白表達(dá)[D].重慶：西南大學(xué)，2009.