響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝

唐華麗 熊漢國(guó) 王 瑋

（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

葡萄籽為落葉藤本植物葡萄的種子，是葡萄酒廠和果汁廠的主要副產(chǎn)品，因其富含多酚類(lèi)物質(zhì)、各種氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分而具有重要的利用價(jià)值［1－3］。研究［4－6］表明，葡萄籽多酚作為葡萄籽提取物的主要成分具有很好的清除自由基、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、輔助抗腫瘤、美容等生理功能。國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄籽多酚的提取工藝進(jìn)行了廣泛研究，但大部分研究存在工藝復(fù)雜［7，8］，耗時(shí)較長(zhǎng)，得率較低［9］等不足。探索葡萄籽多酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)濟(jì)有效的提取工藝有利于提升葡萄籽廢渣的附加值，具有極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)以葡萄籽為研究對(duì)象，采用有機(jī)溶劑法提取其中的多酚類(lèi)物質(zhì)，以多酚提取量為指標(biāo)，采 用Design－Expert軟 件 的Central Composite Design法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化葡萄籽多酚的提取工藝條件，以有效提高葡萄籽資源的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：萬(wàn)州花鳥(niǎo)市場(chǎng)；

無(wú)水碳酸鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醇、沒(méi)食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、無(wú)水硫酸鋰、溴水等：分析純，重慶醫(yī)藥公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV－2450，日本島津公司；

分析天平：ML203，北京賽多利斯公司；

恒溫水浴鍋：HH－4，常州普天儀器制造有限公司；

離心機(jī)：TD5A－WSI，濟(jì)南福的機(jī)械有限公司；

小型組織粉碎機(jī)：JJ－2，萬(wàn)州江東機(jī)械廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52A，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄籽多酚提取工藝

1.3.2 多酚含量的測(cè)定 采用酒石酸亞鐵比色法［10，11］。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制成一定濃度后測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y＝0.586x－0.001 5，R2＝0.996 3。依標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取液中多酚質(zhì)量濃度（mg／mL）。

1.3.3 提取試劑的選擇 取0.500g葡萄籽粉，分別用10倍體積（V／m）70%體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮溶液按照1.3.1工藝流程浸提，比較4種有機(jī)溶劑對(duì)多酚的浸提效果。

1.3.4 提取工藝單因素試驗(yàn)

（1）在提取溫度70 ℃、提取時(shí)間20min、提取次數(shù)3次的條件下，分別考查不同體積分?jǐn)?shù)（10%，30%，50%，70%，90%）的提取溶劑對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響；

（2）在提取溶劑體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)3 次的條件下，分別考查 不同提 取時(shí)間（5，10，20，30，40min）對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響；

（3）在提取溶劑體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間20min、提取次數(shù)3次的條件下，分別考查不同提取溫度（40，50，60，70，80 ℃）對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響；

（4）在提取溶劑體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間20min的條件下，分別考查不同提取次數(shù)（1，2，3，4，5次）對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響。

1.3.5 葡萄籽多酚提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析 本試驗(yàn)采用Design－Expert 8.05b軟件的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的確定

由圖1可知，4種有機(jī)溶劑中，以丙酮為提取試劑的浸提效果最好，提取多酚含量可達(dá)2.468mg／mL，乙酸乙酯次之，甲醇最差。故本試驗(yàn)選用丙酮作為葡萄籽多酚的提取試劑。

2.2 葡萄籽多酚提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了各因素合適的條件范圍，根據(jù)Central Composite Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 提取溶劑類(lèi)型對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響Figure 1 Effects of extraction solvent type on grape seeds polyphenols yield

表1 試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

根據(jù)響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到葡萄籽多酚提取量與各因素變量的二次方程模型：

表3給出了由響應(yīng)面分析法對(duì)上述數(shù)學(xué)模型和正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的方差分析結(jié)果。由方差分析結(jié)果可以看出，該模型P值小于0.01，表明二次方程模型極顯著。而失擬項(xiàng)P值大于0.10不顯著，表明該模型對(duì)試驗(yàn)的擬合情況良好，誤差較小，可以通過(guò)該模型預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。各因素對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響由大到小依次為丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（C）、提取次數(shù)（D）、提取時(shí)間（B）。因素間交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2、3。

表3 葡萄籽多酚提取量的方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis of grape seeds polyphenols yield

圖2 丙酮體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用對(duì)葡萄籽多酚提取量的響應(yīng)面圖Figure 2 Response surface plots showing the effect of acetone concentration and extraction duration

圖3 提取時(shí)間與提取溫度交互作用對(duì)葡萄籽多酚提取量的響應(yīng)面圖Figure 3 Response surface plots showing the effect of extraction duration and extraction temperature

由圖2和圖3可知，丙酮體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間（A）、提取時(shí)間和提取溫度（B）之間的交互作用對(duì)葡萄籽多酚提取量有顯著影響。

根據(jù)響應(yīng)面分析所建立的數(shù)學(xué)模型，以及軟件分析得出響應(yīng)值較大的提取條件（表4試驗(yàn)1～5），將其與響應(yīng)面試驗(yàn)（表2）中提取量最高的試驗(yàn)條件（表4 試驗(yàn)6）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以尋找葡萄籽多酚提取的最佳工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification experiments

由表4可知，當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為72%、提取時(shí)間32min、提取溫度65 ℃、提取次數(shù)4次時(shí)，葡萄籽多酚提取量達(dá)到最大值。

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)采用溶劑法對(duì)葡萄籽中多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取，對(duì)比了4種不同有機(jī)溶劑對(duì)葡萄籽多酚類(lèi)物質(zhì)的提取效果，結(jié)果表明丙酮提取葡萄籽多酚工藝簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、提取率較高。

（2）利用Design－Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)表明葡萄籽多酚的最佳提取工藝條件為丙酮體積分?jǐn)?shù) 72%，提取時(shí)間32 min，提取溫度65 ℃，提取次數(shù)4次，在此條件下多酚提取量可達(dá)2.892mg／mL。

（3）進(jìn)一步提高葡萄籽多酚的提取率還需從釋放與纖維素、蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合態(tài)多酚著手。

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