新疆高葶韭雄蕊開花動態(tài)特征與花粉育性研究

林辰壹，韓文娟，祁晨霞，葉 強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

植物雌雄蕊開放過程中的形態(tài)變化特征與柱頭可授性和花粉育性密切相關(guān)，是植物長期適應(yīng)生態(tài)環(huán)境變化、保障自身在自然條件下繁殖成功的進(jìn)化結(jié)果，對于異花授粉植物而言，花粉作為父本重要的基因流載體，與花粉育性一起決定了雄性親本的遺傳信息是否能夠傳遞給下一代[1]。對于蟲媒花，雄蕊開放中的形態(tài)和時空變化影響到傳粉昆蟲的訪花頻率和時間，最終影響花粉的成功傳遞。因此，雄蕊的形態(tài)特征變化和花粉育性一直是植物繁殖生物學(xué)研究的基本點和出發(fā)點，是分析植物與傳粉者的關(guān)系、交配系統(tǒng)選擇的前提，是植物開花生物學(xué)重要的組成部分[2]。

高葶韭(Alliumobliquum)在中國僅分布于新疆和布克賽爾、沙灣、伊寧等海拔1 200～2 000 m的山地草原和草甸帶中[3]，國外分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、蒙古等國[4]。高葶韭是新疆干旱半干旱特殊環(huán)境下難得的早春野生蔬菜植物資源，一直以來被采集食用[5-6],在國外是重要的觀賞植物資源[7-8]，同時，高葶韭植物的乙醇溶液的提取物對Aspergillusniger、Botrytiscinerea、Fusariumoxysporumsp.gladioli、Penicilliumexpansum以及Sclerotiniasclerotiorum有很強(qiáng)的抑制作用，由于含有天然抑菌成分使其成為植物源性殺菌劑被重視[9]。研究新疆特殊地理環(huán)境條件下高葶韭與環(huán)境相適應(yīng)的生殖生長特點，是摸清自然條件下高葶韭種質(zhì)資源繁殖規(guī)律過程中要解決的首要問題。目前，國內(nèi)外有關(guān)高葶韭雄蕊特征和花粉育性的研究尚未見報道。本研究觀測高葶韭花期其雄蕊的開放動態(tài)，同時檢測花粉活力和花粉萌發(fā)率變化規(guī)律，以期為實現(xiàn)有效保護(hù)利用和人工繁育奠定基礎(chǔ)，為野生蔥屬植物資源繁育系統(tǒng)研究和種質(zhì)資源開發(fā)利用提供理論和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1高葶韭雄蕊開花動態(tài)特征的觀察 高葶韭花期選擇總苞開裂但小花尚未開裂的單花觀察其開花動態(tài)。隨機(jī)掛牌標(biāo)記健康、長勢均勻的、即將開花的20 個花蕾，每天觀察一次直到單花開放后每隔2 h觀察一次，記錄花朵的開放進(jìn)程，直到花藥全部落去花被片閉合[10]。雄蕊特征觀察包括花絲及花藥兩部分。每次觀測時記錄雄蕊數(shù)目、形狀、顏色及雄蕊伸展的時空動態(tài)變化特征，同時，測定空氣的溫度和濕度?；ńz長度測量時，選擇盛花期完全開放、花絲完全伸長、空間分布均一的單花。用鑷子從花絲基部將花絲取下并去除花藥，立即用游標(biāo)卡尺測量各個花絲長度。

1.2高葶韭花粉育性的測定 花粉育性一般用花粉活力和花粉萌發(fā)率衡量[11]。本研究采用5種不同的花粉活力的染色檢驗方法,即0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)、四甲基偶氮唑(MTT)、聯(lián)苯胺、醋酸洋紅、碘-碘化鉀以及離體萌發(fā)法[12-15]。

在田間采集完全伸出花被片還未散粉的、飽滿的、健康的花藥。將尚未散粉的花藥置于PC管中，自然條件下陰干，待自然散粉后立即測定花粉活力。取新鮮花粉置于載玻片上，分別滴入溶液，用解剖針將其混合均勻后，蓋上蓋玻片置于25 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在顯微鏡下觀察著色情況。0.5% TTC溶液染色時培養(yǎng)20～30 min，聯(lián)苯胺染色時靜置3～4 min，碘-碘化鉀染色時培養(yǎng)20～30 min，醋酸洋紅和MTT染色時靜置1～2 min。以經(jīng)過高溫殺死后的無活力花粉的著色能力為對照[14]，比較后判斷花粉活力的有無并確定具有活力花粉的顏色以及顏色變化規(guī)律。每個處理重復(fù)3次，每張片觀察時隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察，每視野不少于30?；ǚ?。用花粉的著色率表示花粉的活力，計算花粉活力百分率。

離體萌發(fā)法以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的硼酸配以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖(分別為 0、5%、10%、15%、20%、25%、30%)。將新鮮的花粉置于載玻片上，先用膠頭滴管將上述培養(yǎng)基滴到載玻片上，培養(yǎng)基凝固后，新鮮花粉均勻地涂抹到培養(yǎng)基上，把載玻片置于底蓋內(nèi)放一張濾紙加入少許蒸餾水的培養(yǎng)皿上，于25 ℃ 的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)。觀察花粉萌發(fā)情況，以花粉管伸長長度超過或等于花粉粒直徑作為已發(fā)芽(萌發(fā))的標(biāo)準(zhǔn)，由此確定高葶韭花粉適宜的培養(yǎng)基后，再測定花粉散粉后的育性變化特點。

2 結(jié)果

2.1高葶韭雄蕊的形態(tài)特征與開花動態(tài) 高葶韭為頂生的傘形花序，兩性花，花期為5月中下旬。單花較小，具6枚綠色花被片，中脈較花被片顏色深，為深綠色；具6枚等長的雄蕊，雄蕊數(shù)量固定。有3個內(nèi)輪花絲和3個外輪花絲，內(nèi)外輪花絲基部合生并與花被片基部貼生0.1～0.2 cm。高葶韭平均花絲長度為0.87～1.02 cm(平均為0.94 cm)。船形的6枚花藥分別以丁字形著生于白色的花絲上，花藥呈縱縫狀開裂，未散粉前呈黃色，散粉時呈淡黃色，散粉后呈深黃色。

高葶韭單花花被片展開到閉合，單花經(jīng)過5個形態(tài)變化時期，即①花被片未展開，小花朵呈燈籠狀；②花藥開始伸出，花被片先端略展開，小花朵呈杯狀；③花藥完全伸出，花被片完全展開，小花朵呈碗狀；④花被片開始閉合，小花朵略張口呈杯狀；⑤花被片完全閉合，小花朵呈燈籠狀。高葶韭單花花被片未開裂小花朵呈燈籠狀時，6枚花藥合抱在柱頭上；高葶韭單花花被片一般在08:30-09:30(17～19 ℃，空氣相對濕度30%～50%)展開，花被片先端略張口小花朵呈杯狀時，花藥開始伸出；花被片完全展開一般在09:30-11:30(20～22 ℃，空氣相對濕度40%～50%)，花朵呈碗狀時花藥全部伸出花被片，這個過程中內(nèi)輪的花絲花藥依次伸出花被片，當(dāng)內(nèi)輪第2枚花藥伸出時，外輪的第1枚花藥伸出，內(nèi)輪第3枚花藥伸出之后，外輪剩余2枚花藥幾乎同時伸出，從第1枚花藥開始散粉到第6枚花藥全部散完粉一般需要10～12 h，最快的3～7 h，最長的12～24 h；單花開放至萎蔫全部過程歷經(jīng)4～5 d(圖 1)。

花藥散粉集中在11:30-19:30(22～30 ℃，空氣相對濕度25%～40%)，單枚花藥從散粉到完全散粉一般需要1.5～2 h，長可達(dá)2～5 h，散粉結(jié)束后的花藥外壁呈桔色，花絲失水萎蔫。從第1枚花藥伸出花被片到花藥全部脫落一般需要4～5 d，此時，花被片完全閉合貼附在子房上。

高葶韭單花開放時內(nèi)輪花被片先展開，內(nèi)輪花絲最先開始伸長，內(nèi)輪花藥先伸出花被片，隨后外輪花被片展開，外輪花藥陸續(xù)伸出花被片后柱頭開始伸長。

圖1 高葶韭雄花開花動態(tài)

開花受環(huán)境的影響，晴天花被片展開較快，花絲伸長和柱頭伸長較長，花藥散粉較快，整個開花過程也將縮短。陰天或雨天花被片展開較慢，花絲伸長不明顯，花藥散粉少或散粉很慢，若連續(xù)幾天溫度較低，整個開花過程將會延長1～2 d。

2.2高葶韭的花粉育性

2.2.1高葶韭花粉的活力 經(jīng)TTC法染色，有活力花粉為淡粉紅色、粉紅色至紅色?；诨ǚ刍盍︻伾蓽\至深的變化，有活力的花粉可以分為弱、中、強(qiáng)3個級別，與對照相比沒有活力或不育花粉為淡黃色。方差分析(表1)表明,2～6 h的著色率在88.9%～100%，無顯著差異，此階段表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力；2～8 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉6 h以后，花粉染色數(shù)量呈下降趨勢，散粉24 h后的花粉著色率為24.1%，且都染為淡粉紅色，花粉活力弱；48 h以后花粉著色率為1.4%。其余全部呈淡黃色，花粉已無活力。

經(jīng)MTT染色，有活力的花粉呈粉紅色、淡紫色至深紫色?；诨ǚ刍盍︻伾蓽\至深的變化，有活力的花粉可以分為弱、中、強(qiáng)3個級別，與對照相比沒有活力或不育花粉呈淡黃色。方差分析(表1)表明,4～6 h的著色率在92.3%～93.7%，無顯著差異，此階段表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力；0～10 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉8 h以后，花粉染色數(shù)量呈下降趨勢，散粉24～72 h的著色率無極顯著差異，24 h后的花粉著色率為14.7%，48 h以后花粉著色率為1.5%，且都染為粉紅色，表現(xiàn)出花粉活力弱。其余全部呈現(xiàn)淡黃色，花粉已無活力。

表1 高葶韭花粉活力與花粉萌發(fā)率

經(jīng)聯(lián)苯胺染色，有活力的花粉呈淡粉紅色、粉紅色至紅色?；诨ǚ刍盍︻伾蓽\至深的變化，有活力的花粉可以分為弱、中、強(qiáng)3個級別，與對照相比沒有活力或不育花粉呈淡黃色。方差分析(表1)表明，散粉后4～6 h的著色率在80.6%～86.6%，無顯著差異，此階段表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力；2～10 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉8 h以后，花粉染色數(shù)量呈下降趨勢，且大部分花粉都呈現(xiàn)粉紅色或淡粉色；散粉36～72 h的著色率無極顯著差異；36 h后的花粉著色率為10.1%，且都染為淡粉紅色，表現(xiàn)出花粉活力弱；48 h以后花粉著色率為2.1%，其余全部呈現(xiàn)淡黃色，花粉已無活力。

花藥散粉后無論何時取樣檢測，經(jīng)醋酸洋紅染色，有活力花粉和對照處理過的無活力或不育花粉染色率均被染成紫紅色，各處理間無顯著或極顯著差異，沒有獲得可以鑒定花粉活性的指標(biāo)，因而無法區(qū)分和判斷花粉活力。

花藥散粉后無論何時取樣檢測，經(jīng)碘-碘化鉀染色，有活力花粉和對照處理過的無活力或不育花粉在染色過程中，花粉在極短的時間內(nèi)由黃色變成金黃色或黃褐色，著色和變色的速度都非?？?，肉眼無法觀察區(qū)分，花粉最終均被染成金黃色或黃褐色，各處理間無顯著或極顯著差異，沒有獲得可以鑒定花粉活性的指標(biāo)，因而無法區(qū)分和判斷花粉活力。

2.2.2高葶韭花粉的萌發(fā) 試驗結(jié)果表明，離體萌發(fā)法測定高葶韭花粉生長能力的適宜蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，不添加或添加過多蔗糖都顯著或極顯著影響花粉萌發(fā)和花粉管生長。在此試驗結(jié)果基礎(chǔ)上采用10%蔗糖配比的培養(yǎng)基進(jìn)行花粉生長能力分析，方差分析(表1)表明，散粉后6 h花粉萌發(fā)率最高，表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力，與其他時間的花粉萌發(fā)率存在極顯著差異。 2～10 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉6 h以后，花粉萌發(fā)率呈下降趨勢，48 h以后花粉萌發(fā)率為0，花粉已無活力。

通過5種染色檢驗方法以及1種萌發(fā)法測定高葶韭花粉育性表明，TTC、MTT、聯(lián)苯胺和離體萌發(fā)可以用來檢驗高葶韭花粉活力和花粉萌發(fā)率(圖2、圖3)，而醋酸洋紅和碘-碘化鉀這2種方法不能真實反映高葶韭花粉活力的變化，因此不適合高葶韭花粉育性的測定。不同檢測手段試驗結(jié)果表明，高葶韭花粉是可育的，其花粉育性的變化規(guī)律也是一致的，高葶韭花粉活力最強(qiáng)的時期在2～8 h，花粉活力(萌發(fā)率)超過 50%(圖3)。

3 討論與結(jié)論

雄蕊開花進(jìn)程中的形態(tài)特征變化表明，高葶韭具有雌雄異熟、雄蕊先熟于雌蕊的花部特征，直接影響著開花、授粉等有性繁殖過程，從而影響種子形成。其6枚花藥分別伸出分別散粉，花藥和花粉逐次逐級呈現(xiàn)相對延長了散粉的總時間，最大程度讓花粉資源有效利用，保障傳粉的成功，是對新疆干旱半干旱地理氣候條件的長期適應(yīng)的結(jié)果，與新疆其他野生蔥屬植物的開花動態(tài)也具有類似特點[16-17]。與新疆荒漠植物的繁殖特點具有一定的一致性[18]。開花特點表明高葶韭為日開型花，4～5 d花期屬于短壽命花。

圖2 高葶韭花粉育性測定

圖3 高葶韭花粉活力與花粉萌發(fā)率

高葶韭花藥散粉后，花粉高于50%的活力或萌發(fā)率只能維持2～10 h，48 h后無活力或萌發(fā)率，屬于短壽命花粉。這與經(jīng)氯化三苯基四氮唑染色法檢測3種野生蔥屬植物蒙古韭、堿韭和細(xì)葉韭花粉活力的結(jié)果一致，花粉活力均在開花初期較高，花粉壽命均約8 h[19]。生產(chǎn)實踐中，為了解決親本花期不一致或遠(yuǎn)距離雜交的困難，需要保存花粉的活力，因此花粉生活力測定是進(jìn)行人工輔助授粉或雜交授粉的基礎(chǔ)，同樣，也是高葶韭野生植物資源保護(hù)和合理開發(fā)利用的前提。

在許多植物資源花粉育性檢驗中都存在適宜的檢測手段[20-21]，韭菜花粉活力檢測的最佳方法是離體萌發(fā)法，而碘-碘化鉀法、TTC法和無機(jī)酸法不適合韭菜花粉生活力的檢測[22]，由于單一染料只反映花粉細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)育的一個指標(biāo)，因而本試驗采用多種染色方法更客觀地判斷花粉的活性，TTC染色法、MTT法、聯(lián)苯胺法、離體萌發(fā)法適用于測定高葶韭花粉育性，且可以通過顏色變化將花粉活力分級，而醋酸洋紅法、碘-碘化鉀法不適用于測定高葶韭花粉育性，可為野外操作提供更加實用、便捷、可靠的方法，需要強(qiáng)調(diào)的是花粉活力測定研究中一定要將人工殺死的花粉設(shè)置成無活力花粉作為對照，比較它們之間的花粉著色能力有助于提高試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

花粉活力測定方法表現(xiàn)出的選擇性是與花粉體內(nèi)各種酶活性和物質(zhì)含量與組成相關(guān)，為進(jìn)一步開展小孢子培養(yǎng)、花粉發(fā)育與花藥內(nèi)源激素變化、花粉生理結(jié)構(gòu)與代謝特點、花粉生態(tài)適應(yīng)性、外源物質(zhì)對花粉育性調(diào)控、花粉育性與結(jié)實關(guān)系等方面研究提供有價值的參考。

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