芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物在防治油菜菌核病中的作用

伍輝軍，王 帥，湛 江，馬玲莉，高學(xué)文

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點實驗室，南京 210095）

油菜菌核病是我國油菜第一大病害，該病由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）引起，一般發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重時可達80%以上[1]。油菜菌核病一旦發(fā)作，常會連年發(fā)生，嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量和質(zhì)量，造成巨大經(jīng)濟損失，病情嚴(yán)重時，可使油菜減產(chǎn)30%[2]。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)真正抗核盤菌的油菜種質(zhì)資源，防治油菜菌核病主要依賴化學(xué)防治。然而，化學(xué)農(nóng)藥已使核盤菌產(chǎn)生強抗藥性[3]，導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥使用量和使用頻度不斷加大，增加了環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量，對環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，亟需研究和開發(fā)新型環(huán)保菌核病生物防治藥劑。

近年來，生物防治以其無公害、無污染等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注。目前，在生防領(lǐng)域中，芽胞桿菌（Bacillus spp.）是研究和應(yīng)用相對較多的一類細菌，該菌分布廣泛，能產(chǎn)生抗逆性強的芽胞、多種抗生素和酶類物質(zhì)[4]。芽胞桿菌防治植物病害的主要活性物質(zhì)是脂肽類化合物，包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和泛革素（Fengycin）三大類[5]。其中，Surfactin具有抑制病毒和細菌的活性[5]。泛革素對絲狀真菌具有很強的抑制效果[6]。伊枯草菌素能有效抑制真菌和細菌[7]。表面活性素和泛革素還能作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[8]。因此，可以利用芽胞桿菌產(chǎn)生的這類獨特化合物，研制新型環(huán)保生物源農(nóng)藥。

本研究檢測了芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物抑制油菜菌核病菌的活性，并采用油菜離體葉片接種法和田間試驗，評價脂肽類化合物防治油菜菌核病效果。該研究有助于油菜菌核病的生物防治，以及新型環(huán)保生物源農(nóng)藥研制。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜品種為Z生3。油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）G4菌株和解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B3菌株為本實驗室保存。芽胞桿菌培養(yǎng)采用LB和Landy培養(yǎng)基[9]；真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[10]。42%克菌凈可濕性粉劑購置于湖南省海洋生物工程有限公司。脂肽類生物農(nóng)藥乳油的制備：芽胞桿菌在Landy培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵條件參考王帥等方法[11]。發(fā)酵結(jié)束后，采用酸沉淀法提取脂肽類化合物，并對粗提的脂肽類化合物進行稱重，再溶于助溶劑乙醇，最終配制成50 mg·L-1脂肽類生物農(nóng)藥乳油。

1.2 脂肽類生物農(nóng)藥乳油抗菌活性檢測

以油菜菌核病菌為指示菌，用紙碟法檢測脂肽類生物農(nóng)藥乳油抗菌活性。先用打孔器從培養(yǎng)的菌核病菌上取直徑為4 mm的菌絲塊，移至PDA平板中央，在距離中央兩側(cè)各1.5 cm處放置直徑為4 mm濾紙片，在濾紙上加脂肽類生物農(nóng)藥乳油10 μL，對照以無菌水測試，每個試驗3個處理，于28℃下培養(yǎng)3 d后測量各處理抑菌圈。

1.3 油菜離體葉片接種試驗

在油菜10葉期，摘取葉位一致、大小相近的無破損、無病蟲害葉片，自來水清洗，晾干，滴加0.5 mL脂肽類生物農(nóng)藥，涂抹均勻，用滅菌去離子水處理葉片作對照（CK），自然晾干，接種生長旺盛的油菜菌核病菌菌絲塊，每片葉片放置2個菌絲塊，于25℃保濕培養(yǎng)2 d，然后測量病斑直徑。每次處理重復(fù)4次。

1.4 脂肽類生物農(nóng)藥乳油防治油菜菌核病的田間試驗

試驗共設(shè)脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3、G4、42%克菌凈可濕性粉劑和空白對照4個處理。小區(qū)面積40 m2，隨機區(qū)組排列，每個處理重復(fù)4次。各藥劑使用濃度分別為：脂肽類生物農(nóng)藥每畝40 mL，42%克菌凈可濕性粉劑3.34 g·hm-2。分別在油菜的初花期和盛花期施藥，每次施藥按藥量兌水3.34 kg·hm-2，用長江-10A型手動噴霧器均勻噴霧（噴孔直徑1.3 mm，工作壓力3～4 kg·cm-2），空白對照噴等量清水。于盛花期藥后10 d調(diào)查1次。每小區(qū)棋盤式10點調(diào)查，每點調(diào)查5株（每個小區(qū)50株），調(diào)查時不要在邊行取樣，記載各級發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS對上述處理間的試驗結(jié)果進行差異顯著性分析，比較試驗中不同處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4對油菜菌核病菌的平板拮抗作用

結(jié)果表明，脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4均能夠明顯抑制油菜菌核病菌菌絲生長（見圖1）。B3和G4平均抑菌圈面積分別為4.71和3.85 cm2，差異顯著性分析表明，抑菌圈在顯著性水平5%時各處理間與清水對照間有顯著性差異，且B3效果要好于G4；在顯著性水平1%時各處理與清水對照存在極顯著性差異，B3和G4處理之間無顯著性差異。

圖1 B3和G4對油菜菌核病菌菌絲生長的影響Fig.1 Inhibition effect of B3 and G4 on S.sclerotinorium in plate

2.2 油菜離體葉片接種核盤菌試驗

試驗結(jié)果表明，在接種核盤菌后24 h，對照葉片開始發(fā)病，此時B3和G4處理葉片均未發(fā)?。ㄒ妶D2-A）。在接種核盤菌后36 h，對照葉片開始大面積發(fā)病，G4處理葉片開始輕微發(fā)病，B3處理葉片未發(fā)病（見圖2-B）；在接種核盤菌后48 h，對照葉片開始大面積腐爛，G4處理葉片有直徑為1.5 cm左右的病斑，B3處理葉片未發(fā)病，而對照處理的葉片則出現(xiàn)直徑為3.7 cm左右的病斑（見圖2-C）。差異顯著性分析表明，各處理間及與清水對照在顯著性水平1%時存在極顯著性差異。此外，接種后48 h內(nèi)，對照逐漸退色，而處理葉片依然鮮綠。

圖2 油菜離體葉片上B3和G4對油菜菌核病菌的抑制作用Fig.2 B3 and G4 supress the growth of S.sclerotinorium on detached leaves of rape

2.3 脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4防治油菜菌核病的田間試驗

試驗結(jié)果表明，在連續(xù)兩年的試驗中經(jīng)B3和G4處理后，油菜病株率與病情指數(shù)逐年下降，并且在油菜整個生育期都具有很好防治效果（見圖3，表1）。第一年B3和G4防效分別達到49.7%和44.8%；第二年B3和G4防效分別達到55.8%和46.3%。與化學(xué)農(nóng)藥克菌凈在兩年內(nèi)的防效51.5%和47.4%相近。差異顯著性分析表明，在第一年試驗中，在差異顯著性5%時B3與克菌凈處理間無顯著性差異；G4與克菌凈處理間有顯著性差異（見表1）。在第二年試驗中，在差異顯著性5%時B3與克菌凈處理間有顯著性差異，且B3處理防效高于克菌凈；G4與克菌凈處理間無顯著性差異（見表1）。

圖3 脂肽類生物農(nóng)藥乳油防治油菜菌核病Fig.3 Controlling of S.sclerotinorium with biopesticides of lipopeptide

表1 脂肽類生物農(nóng)藥乳油防治油菜菌核病的田間試驗Table 1 Controlling of S.sclerotinorium with biopesticides of lipopeptide in the field

2.4 脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4對油菜生長的影響和對油菜生長的安全性

油菜經(jīng)脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4處理后，于盛花期藥后10 d調(diào)查，結(jié)果表明，脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4處理均具有促進油菜生長的作用（見表2）。每667 m2油菜經(jīng)脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3或G440 mL處理后，油菜株高分別為145.8和144.7 cm，地上部鮮重分別為293.3和261.2 g。差異顯著性分析表明，株高方面在顯著性水平5%時，脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3與清水對照有顯著性差異；在顯著性水平1%時各處理與清水對照均無顯著性差異；地上部鮮重在顯著性水平5%和1%時脂肽類生物農(nóng)藥乳油各處理與清水對照均有顯著性差異。

表2 脂肽類生物農(nóng)藥乳油對油菜生長的影響Table 2 Effects of biopesticides of lipopeptide on the growth of rape in field

3 討論與結(jié)論

芽胞桿菌屬于植物根圍促生細菌（Plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR），其通過成功定殖至植物根際、體表或體內(nèi)，與病原菌競爭生存空間和營養(yǎng)物質(zhì)，還能分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長，同時誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性抵御病原菌入侵，從而起到生防作用。目前，在國內(nèi)外商品化的芽胞桿菌生防制劑中都是直接利用菌體作為活性物質(zhì)，生防效果不穩(wěn)定，易受到環(huán)境因素影響。芽胞桿菌防治植物病害主要的生防機制是產(chǎn)生拮抗物質(zhì)。自Johnson等報道芽胞桿菌能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)以來[12]，研究者從芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)60多種拮抗物質(zhì)，而最主要的拮抗物質(zhì)就是通過非核糖體途徑合成脂肽類化合物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的差異分為Surfactin、Iturins和Fengycin三類。本研究直接利用芽胞桿菌代謝產(chǎn)物脂肽類化合物防治油菜菌核病，檢測脂肽類化合物在實驗室和田間防治效果。

脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4對油菜菌核病的平板拮抗試驗表明，B3和G4與核盤菌形成明顯拮抗圈（見圖1），當(dāng)B3和G4與核盤菌菌落接觸后，核盤菌菌落停止生長，對照則長滿整個平板。油菜離體葉片接種試驗中，脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4處理油菜葉片后接種核盤菌，B3和G4對核盤菌在葉片上的侵染和擴展有較強抑制作用，尤其是B3處理完全抑制核盤菌侵染（見圖2）。在田間試驗中，經(jīng)過不同處理后的油菜病株率和病情指數(shù)都大大低于對照。其中，B3處理最高防效達55.8%，顯著高于克菌凈防效（見表1），說明脂肽類生物農(nóng)藥乳油B3和G4在田間條件下能對核盤菌定殖和生長起抑制作用。先前研究表明，B3菌株能夠產(chǎn)生脂肽類化合物Iturins和Fengycin，G4菌株能夠產(chǎn)生脂肽類化合物Surfactin、Iturins和Fengycin，其中Iturins和Fengycin都具有很強的抑制真菌的活性[13]。因此，本試驗認(rèn)為脂肽類生物農(nóng)藥對油菜菌核病的防治主要是由于Iturins和Fengycin對油菜菌核病原菌的抑制作用。試驗表明，脂肽類生物農(nóng)藥乳油對環(huán)境和作物安全，未發(fā)生藥害現(xiàn)象且具有顯著促生效果（見表2）。

在植物病害生物防治領(lǐng)域中，利用生防菌及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是生物防治的重要研究內(nèi)容。目前，直接利用芽胞桿菌產(chǎn)生脂肽類化合物防治植物病害還未見報道，因此該研究將有助于新型環(huán)保型生物源農(nóng)藥開發(fā)和研制。

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