SSR分子標(biāo)記分析彩色馬鈴薯品種間的遺傳關(guān)系

李先平，王冬冬，陳秀華,，朱延明，陳 勤,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部萊斯布里奇研究中心，萊斯布里奇，艾伯塔省，加拿大 T1J4B3；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，昆明 650205）

馬鈴薯是世界上種植最廣泛的糧食作物之一，也是人類飲食中重要的抗氧化活性食物的來源。馬鈴薯中含有多酚、類胡羅卜素、類黃酮和維生素C等多種抗氧化活性物質(zhì)。近年開發(fā)的彩色馬鈴薯除含有以上各種抗氧化活性物質(zhì)外，還含有多種花青素色素，使其抗氧化活性比常見的白肉和黃肉馬鈴薯增加2～3倍[1]，食用彩色馬鈴薯更有益于人體健康，這使得育種學(xué)家把目標(biāo)集中到高色素含量的彩色馬鈴薯新品種選育上。Reyes等研究發(fā)現(xiàn)彩色馬鈴薯塊莖薯皮含有較多的花青素色素[2]，其含量比薯肉高出0.9～1.6倍，但薯皮對(duì)花青素的貢獻(xiàn)只有整個(gè)塊莖的20%左右，馬鈴薯花青素主要還是來自于薯肉，因而培育高色素含量彩色馬鈴薯新品種關(guān)鍵在于薯肉色素含量高低。

隨著彩色馬鈴薯抗氧化、抗癌、抑制腫瘤活性等諸多保健功能的發(fā)現(xiàn)利用，彩色馬鈴薯成為當(dāng)前馬鈴薯育種研究熱點(diǎn)。目前彩色馬鈴薯的研究主要集中于色素含量、色素穩(wěn)定性及保健功能等方面，研究使用的彩色品種為國際上現(xiàn)有品種如“Russian Blue”，“Purple Peruvian”和“Purple Majesty”等紫肉品種和“Mountain Rose”、“Red Cardinal”等紅肉品種[3-4]。而這些彩色馬鈴薯品種來源、遺傳背景等尚不清楚，因此對(duì)彩色馬鈴薯品種間遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的彩色馬鈴薯彼此雜交，發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)，有利于培育色素含量更高的彩色馬鈴薯新品種。

分子標(biāo)記技術(shù)廣泛用于植物遺傳育種、品種鑒定、生物多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與克隆和分子標(biāo)記輔助育種等諸多領(lǐng)域。其中SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列），又稱微衛(wèi)星（Microsatellite），由1～6個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)的DNA序列組成，其序列側(cè)翼具有高度保守的DNA序列，重復(fù)次數(shù)差異較大，是檢測(cè)多態(tài)性的有效方法。SSR具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性高、數(shù)量和信息量豐富、共顯性遺傳等特點(diǎn)，被廣泛用于動(dòng)植物遺傳研究中。1995年Veilleux等首次利用SSR分子標(biāo)記研究馬鈴薯[5]，其后SSR分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯的遺傳關(guān)系分類[6-8]、品種鑒定[9]、核心種質(zhì)資源收集評(píng)價(jià)[10]等領(lǐng)域。

目前已開發(fā)200多個(gè)馬鈴薯SSR分子標(biāo)記引物，Milbourne等公布了遍布馬鈴薯12條染色體的112個(gè)SSR分子標(biāo)記引物[11]；Ashkenazi等開發(fā)出30對(duì)SSR引物用于研究馬鈴薯野生種與普通栽培種的多態(tài)性[12]；Feingold等通過EST數(shù)據(jù)庫的DNA序列信息設(shè)計(jì)開發(fā)了64個(gè)SSR引物用于馬鈴薯遺傳圖譜構(gòu)建[13]。Ghislain等于2004年通過對(duì)近1000個(gè)馬鈴薯品種和品系的篩選鑒定[9]，從156對(duì)SSR引物中篩選出18對(duì)表現(xiàn)好的SSR引物用于馬鈴薯研究，并于2009年通過對(duì)742個(gè)馬鈴薯品種的篩選鑒定，將多態(tài)性好、信息量大、重復(fù)性好的SSR引物從原來的18對(duì)SSR引物擴(kuò)增至24對(duì)[14]。Spooner等用50對(duì)SSR引物對(duì)742個(gè)馬鈴薯品種8個(gè)馬鈴薯野生種進(jìn)行多態(tài)性分析，對(duì)不同染色體倍性，不同來源的馬鈴薯進(jìn)行分類研究[10]。

相較于其他分子標(biāo)記技術(shù)，SSR分子標(biāo)記多態(tài)性好，簡(jiǎn)便易用，重復(fù)性好，更適合于植物品種鑒定和遺傳多樣性研究。本文旨在利用SSR分子標(biāo)記研究彩色馬鈴薯品種間的遺傳關(guān)系，分析彩色馬鈴薯的遺傳背景及其親緣關(guān)系，以便更好的為彩色馬鈴薯遺傳育種服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)采用來自北美、歐洲和國際馬鈴薯中心不同顏色馬鈴薯品種及彩色馬鈴薯育種中間材料進(jìn)行研究。表1列出了試驗(yàn)材料的品種名稱、來源和品種的皮色、肉色等主要特征特性。

表1 用于SSR分析的彩色馬鈴薯品種Table 1 Color potato cultivars for SSR marker analysis

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及SSR分析

DNA提取使用植物DNA提取試劑盒（D Neasy Plant Mini Kit，Qiagen，Maryland，USA），用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]，選擇多態(tài)性好的SSR引物進(jìn)行彩色馬鈴薯多態(tài)性研究，SSR引物信息如表2所示。

表2 用于彩色馬鈴薯品種遺傳多樣性分析的SSR引物信息Table 2 SSR primer for genetic diversity analysis of color potato cultivars

續(xù)表

PCR反應(yīng)使用PCR反應(yīng)試劑盒（Taq PCR Master Mix Kit，Qiagen），反應(yīng)體系15 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)：94℃變性30 s，退火溫度（引物退火溫度見表2）退火30 s，72℃延伸50 s；最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf mastercycler）上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，200 V電泳1～1.5 h。電泳后用1%硝酸銀進(jìn)行銀染，銀染好的凝膠用數(shù)碼相機(jī)在膠片觀察燈下進(jìn)行拍照。凝膠電泳和銀染方法參照國際馬鈴薯中心的實(shí)驗(yàn)程序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSR位點(diǎn)上銀染帶型的有無，轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”。二進(jìn)制數(shù)據(jù)組成矩陣，利用簡(jiǎn)單匹配系數(shù)（Simple matching coefficient，SM）計(jì)算相似性系數(shù)，然后進(jìn)行UPGMA聚類分析，自動(dòng)生成樹狀圖。NTSYS-PC 2.1軟件用于計(jì)算遺傳相似性和聚類分析。

多態(tài)性信息量值PIC（Polymorphism index contents）采用Nei's多樣性指數(shù)公式獲得：PICk=1-∑(Pi)2，其中Pi是帶有第i個(gè)等位基因在k位點(diǎn)上的群體比例，計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC值。

2 結(jié)果與分析

研究使用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取DNA。結(jié)果表明試劑盒提取的DNA質(zhì)量好，無降解，品種間DNA提取量均勻（見圖1），經(jīng)稀釋后可用于SSR分析。

圖1 馬鈴薯DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agrose electrophoresis of potato DNA

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

表3顯示了SSR引物對(duì)彩色馬鈴薯進(jìn)行分析的多態(tài)性信息。41對(duì)SSR引物在試驗(yàn)中共獲得152個(gè)SSR擴(kuò)增條帶，其中有24條帶為所有品種共有，在品種間不具有多態(tài)性；另外128條帶在品種間存在差異，顯示多態(tài)性。SSR引物在各品種間顯示1～11個(gè)多態(tài)性條帶，PIC值變幅為0.32～0.94，平均值0.76。其中PIC值達(dá)到和高于0.9的有4個(gè)：引物STG0016在PCR擴(kuò)增中獲得11個(gè)條帶，其中10個(gè)顯示為多態(tài)性條帶，PIC值為0.94；引物STI003的9個(gè)位點(diǎn)均為多態(tài)性條帶，PIC值為0.93；引物STI024的9個(gè)位點(diǎn)中8個(gè)顯示為多態(tài)性條帶，PIC值為0.93；引物STM1104的6個(gè)均為多態(tài)性條帶，PIC值為0.9。以上4對(duì)引物在品種間顯示了良好的多態(tài)性，適合用于馬鈴薯品種間的多態(tài)性分析；PIC在0.80～0.89之間的有15對(duì)引物，亦表現(xiàn)出較好的多態(tài)性；PIC值在0.70～0.79的有12對(duì)引物；PIC值在0.60～0.69之間的有4對(duì)引物；PIC值在0.50～0.59之間的有5對(duì)引物；PIC值低于0.5的有1對(duì)引物。圖2為引物STI024擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。

表3 SSR引物分析30個(gè)彩色馬鈴薯品種的多態(tài)性信息Table 3 Polymorphisms revealed by SSR primer in 30 color potato cultivars

圖2 引物STI024對(duì)30個(gè)彩色馬鈴薯品種PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果Fig.2 Result of electrophoresis of PCR products using STI024 for 30 color potato varieties

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，PIC值達(dá)到0.9的4對(duì)引物擴(kuò)增出的35條帶能把參試30個(gè)品種全部區(qū)分開來，說明多態(tài)性好的SSR引物適用于大部分馬鈴薯品種的多態(tài)性研究。用PIC值達(dá)到0.8的19對(duì)引物對(duì)參試品種進(jìn)行聚類分析，不僅能把所有30個(gè)品種全部區(qū)別開，并且19對(duì)引物的聚類結(jié)果和所有41對(duì)SSR引物進(jìn)行聚類分析的結(jié)果高度相似，說明篩選多態(tài)性好的SSR引物能更高效地對(duì)馬鈴薯品種進(jìn)行遺傳多態(tài)性研究。

2.2 SSR引物檢測(cè)的特異性位點(diǎn)分析

在SSR擴(kuò)增結(jié)果中，我們檢測(cè)到一些品種和組合特異性的條帶（見表4）。3個(gè)特異性條帶STI060-170、STG0010-190和STM0025-150能單一識(shí)別品種G06-33-10；條帶STI017-170能檢測(cè)品種Atlantic；STI023-120能識(shí)別品種Shepody；2個(gè)特異性條帶STM0028-150和STM0031-180能檢測(cè)來源于CIP的二倍體彩色馬鈴薯資源G06-24-4和G06-33-10；特異性條帶STM1106-145能專一檢測(cè)來源于CIP的四倍體彩色馬鈴薯資源G06-36-23和G06-38-2；2個(gè)特異性條帶STM1024-220和STM2024-230能從參試品種中檢測(cè)出品種1024-1065和1003-329；2個(gè)特異性條帶STI048-270和STM1029-140能檢測(cè)品種2004-1233和Purple Majesty；條帶STM-

1017-180能檢測(cè)品種Purple Valley和1022-8017；STM0028-160能專一檢測(cè)來源于CIP的4個(gè)彩色馬鈴薯種質(zhì)G06-36-23、G06-38-2、G06-24-4和G06-33-10；STM1055-190檢測(cè)的4個(gè)馬鈴薯品種Norland、Russet Burbank、Shepody和 Dermot Lynch均為白肉品種，該條帶可能與馬鈴薯白色薯肉相關(guān)。

表4 SSR分子標(biāo)記檢測(cè)到的彩色馬鈴薯品種特異性位點(diǎn)Table 4 Accession and group specific SSR alleles detected in color potato cultivars

2.3 彩色馬鈴薯品種聚類分析

表3顯示SSR引物對(duì)30個(gè)彩色馬鈴薯品種進(jìn)行分析的結(jié)果，在各個(gè)品種中檢測(cè)到66～106個(gè)等位位點(diǎn)，平均每個(gè)品種檢測(cè)到92個(gè)等位位點(diǎn)。根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)，使用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見圖3。參試30個(gè)品種在SM=0.65處分為兩個(gè)主要聚類群，類群Ⅰ共有23個(gè)品種，包括各種顏色馬鈴薯品種，所有品種均為馬鈴薯普通栽培種（S.tuberosum），品種間遺傳相似度較高。類群Ⅰ在SM=0.72處又可以分為5個(gè)亞群：亞群Ⅰ.1中除品種All Red為紅色馬鈴薯外，其他均為紫皮紫肉馬鈴薯品種，可視為紫色馬鈴薯品種亞群。亞群Ⅰ.2和Ⅰ.3主要為紅色馬鈴薯品種，9個(gè)品種中只有Atlantic和Shepody是白皮白肉，其他均為紅皮紅肉，可視為紅色馬鈴薯亞群；亞群Ⅰ.4和Ⅰ.5共7個(gè)品種，其中Norland為紅皮白肉，Northstar、Russet Burbank和Stirling均為白皮白肉，而另外3個(gè)彩色馬鈴薯則均為白皮白肉品種雜交后代，其中1003-329為Northstar后代，1014-308和1006-638親本之一為Stirling，因此類群Ⅰ.4和Ⅰ.5可歸為白色馬鈴薯亞群。

圖3 30個(gè)彩色馬鈴薯品種的SSR譜帶聚類分析結(jié)果Fig.3 Dendrogram of cluster analyses of 30 color potato cultivars by SSR screen

類群Ⅱ共有7個(gè)品種，包括參試品種中其他馬鈴薯種質(zhì)材料，在SM=0.66處分為2個(gè)亞群，亞群Ⅱ.1中2004-1233為二倍體野生種S.pinnatisectum和普通栽培種體細(xì)胞雜種，G06-24-4和G06-33-10是來自國際馬鈴薯中心的二倍體原始栽培種S.stenotomum的雜交后代。該亞群包括參試品種中所有已知二倍體血緣的試驗(yàn)材料。亞群Ⅱ.2是來自國際馬鈴薯中心的S.andigena亞種和普通栽培種的雜交后代。

3 討 論

各種不同的分子標(biāo)記應(yīng)用于馬鈴薯遺傳多樣性、系統(tǒng)分類以及指紋圖譜建等研究。Grg等用RFLP分子標(biāo)記鑒定德國馬鈴薯品種[15]；Ghislain等用RAPD分子標(biāo)記分析馬鈴薯原始栽培種S.phureja的種間變異情況[16]；Kim等使用AFLP分子標(biāo)記對(duì)馬鈴薯品種進(jìn)行識(shí)別[17]；Bornet等用ISSR分子標(biāo)記比較來源于歐洲和阿根廷馬鈴薯品種的異同[18]。相較于上述各種分子標(biāo)記，由于SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性好、重復(fù)性好和方便利用的優(yōu)點(diǎn)。本研究使用SSR分子標(biāo)記對(duì)彩色馬鈴薯進(jìn)行遺傳多樣性研究Milbourne等用3種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記評(píng)價(jià)16個(gè)馬鈴薯栽培品種多樣性[19]，發(fā)現(xiàn)SSR分子標(biāo)記在分析馬鈴薯品種間遺傳距離時(shí)效率更高，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)了112對(duì)SSR引物用于馬鈴薯研究。王紹鵬等對(duì)SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，并把SSR多重PCR反應(yīng)體系應(yīng)用到馬鈴薯分子標(biāo)記研究中[20-21]。Ghislain等總結(jié)的“馬鈴薯遺傳鑒定試劑盒”（Potato genetic identity kit）共包括24對(duì)SSR引物，在馬鈴薯12條染色體的每條染色體上分布有2對(duì)SSR引物，其對(duì)742個(gè)馬鈴薯品種識(shí)別效率達(dá)93.5%[14]。

為更好研究彩色馬鈴薯遺傳多樣性，在以上24對(duì)SSR引物基礎(chǔ)上，還收集了文獻(xiàn)報(bào)道中多態(tài)性、重復(fù)性好的SSR引物用于本研究彩色馬鈴薯多態(tài)性分析。從聚類分析結(jié)果看，馬鈴薯品種聚類分成2個(gè)類群，類群Ⅰ全部為普通栽培種，包括大多數(shù)彩色馬鈴薯品種和北美栽培面積較大的白色薯肉品種。這些品種根據(jù)顏色不同分成3個(gè)亞群：紫色品種亞群、紅色品種亞群和白色品種亞群。SSR引物來自遍布馬鈴薯12條染色體的遺傳位點(diǎn)，研究根據(jù)遺傳相似度聚類，把彩色馬鈴薯不同顏色品種大致歸類，說明馬鈴薯顏色為多基因控制，色素相關(guān)基因位于多條染色體上。同時(shí)由于參試彩色馬鈴薯品種多來自于北美，遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近，因此品種間色素上的差異能被SSR聚類區(qū)分開。

類群Ⅱ除了2個(gè)北美現(xiàn)有的彩色馬鈴薯品種外，包括了參試品種中其他種質(zhì)來源的馬鈴薯材料，其中3個(gè)來自二倍體種：1個(gè)有野生種S.pinnatisectum血緣，2個(gè)是原始栽培種S.stenotomum后代。類群Ⅱ的另外2個(gè)品種為普通栽培種安第斯栽培亞種（S.andigena）后代，馬鈴薯四倍體種的彩色馬鈴薯性狀主要來種于該亞種，但經(jīng)多年的農(nóng)藝性狀改良和定向選擇，使得現(xiàn)代栽培的彩色馬鈴薯品種與安第斯栽培亞種之間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖3）。類群Ⅱ包括二倍體和四倍體的彩色馬鈴薯種質(zhì)，這些種質(zhì)代表馬鈴薯品種中顏色性狀的原始來源，在色素表現(xiàn)上和北美彩色馬鈴薯品種相似，但在其他性狀如植株、葉片形狀、塊莖薯形、芽眼深淺等植物學(xué)特征上與其他彩色馬鈴薯品種間差異很大。SSR聚類從進(jìn)化關(guān)系上把彩色馬鈴薯種質(zhì)劃分成兩類，一類為現(xiàn)代的彩色馬鈴薯栽培品種，在農(nóng)藝性狀，適應(yīng)性和產(chǎn)量等方面經(jīng)過改良馴化，適宜現(xiàn)代的馬鈴薯生產(chǎn)加工。另一類則代表了彩色馬鈴薯種質(zhì)的來源，是彩色馬鈴薯未經(jīng)改良前的種質(zhì)資源，這些資源具有更豐富的彩色色素基因，是馬鈴薯品種選育的寶貴種質(zhì)資源。從聚類關(guān)系圖看出，類群Ⅰ中的彩色馬鈴薯品種間親緣關(guān)系近，相似度高，遺傳背景相似，彼此間不宜再用作雜交育種的親本配對(duì)。而類群Ⅱ不僅與類群Ⅰ的彩色馬鈴薯關(guān)系較遠(yuǎn)，類群內(nèi)的種質(zhì)間來源也不相同，彩色馬鈴薯育種中利用類群Ⅰ和類群Ⅱ彼此進(jìn)行雜交可以拓展彩色馬鈴薯遺傳背景，提高彩色馬鈴薯新品種選育效率。

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