擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的酶水解研究進(jìn)展

徐 斐，趙 潔，曹 慧，于勁松

（上海理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究所，上海 200093）

目前，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥已有70多個(gè)品種。2003年，該品種農(nóng)藥市場(chǎng)銷售總額為13.0億美元，占所有農(nóng)藥市場(chǎng)份額的19.5%，僅次于銷售總額為16.3億美元的有機(jī)磷農(nóng)藥[1]。近年來(lái)，有學(xué)者預(yù)測(cè)，隨著甲胺磷等5種高毒農(nóng)藥全面退市，國(guó)內(nèi)農(nóng)用市場(chǎng)對(duì)擬除蟲菊酯的需求會(huì)日益增大，國(guó)內(nèi)衛(wèi)生用菊酯的需求在未來(lái)5～10年也將處于加速增長(zhǎng)的黃金時(shí)期[2]。

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在體內(nèi)易被氧化酶系統(tǒng)降解，因此，一直認(rèn)為其具有高效、低毒、易分解、殘留少等優(yōu)點(diǎn)。但近期有研究表明，此類農(nóng)藥具有蓄積毒性等缺點(diǎn)，長(zhǎng)期低劑量接觸會(huì)引起慢性疾病，對(duì)哺乳動(dòng)物具有中等神經(jīng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性、心血管毒性和遺傳毒性，有些品種甚至具有致畸、致癌、致突變作用[3-7]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)探討作用途徑與劑量-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的毒性機(jī)制進(jìn)行研究，一致認(rèn)為該類農(nóng)藥主要對(duì)神經(jīng)細(xì)胞膜鈉通道起作用。Sogorb等認(rèn)為，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)鈉離子通道具有高親和力，通過(guò)改變通道功能會(huì)產(chǎn)生毒性作用[8]。擬除蟲菊酯通過(guò)作用鈉離子通道，使通道電壓閘門關(guān)閉延遲、去極化延長(zhǎng)，形成去極化后電位或重復(fù)去極化，從而抑制中樞神經(jīng)細(xì)胞膜的γ-氨基丁酸受體，降低氨基丁酸對(duì)大腦的抑制性功能，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增高。高濃度擬除蟲菊酯易引起神經(jīng)細(xì)胞膜完全去極化，導(dǎo)致神經(jīng)元持續(xù)興奮，低濃度則易引起間歇性興奮作用。研究表明只需改變鈉離子通道的1%就足以誘導(dǎo)過(guò)度興奮。David等指出，擬除蟲菊酯的急性毒性對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用表現(xiàn)為藥理學(xué)控制行為，擬除蟲菊酯的敏感性在通過(guò)鈉通道亞型時(shí)表現(xiàn)出異質(zhì)性，但是其分布與功能目前還有待深入研究[9]。

正因?yàn)閿M除蟲菊酯具有以上毒性特征，其降解途徑和機(jī)制引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。氧化和水解是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥主要降解途徑，其中最有效的是羧酸酯酶催化擬除蟲菊酯酯鍵的水解，其降解效果與酶的來(lái)源、酶的形式及水解反應(yīng)的溫度、pH等因素密切相關(guān)。本文將結(jié)合酶催化擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的水解機(jī)制，介紹擬除蟲菊酯類農(nóng)藥酶水解的研究進(jìn)展，包括酶的選取、純化、固定化以及水解反應(yīng)條件的優(yōu)化，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的酶水解機(jī)制

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥品種繁多，結(jié)構(gòu)各異，但目前使用較多品種如甲氰菊酯、殺滅菊酯等，其共同特征均含有酯鍵。生物體內(nèi)所含的酶特別是酯酶，在多數(shù)情況下屬于關(guān)鍵酶，具有很強(qiáng)的專一性，水解與酯有關(guān)的物質(zhì)，使酯鍵斷裂，從而降解含酯鍵的農(nóng)藥。擬除蟲菊酯的酶水解機(jī)制見圖1。

圖1 酯酶水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的通式Fig.1 Fomula for the course of esterase hydrolyzing pyrethroids

目前，這方面的研究主要集中在：通過(guò)剖析酶催化農(nóng)藥水解獲得產(chǎn)物，進(jìn)一步探討酶催化水解反應(yīng)機(jī)理。虞云龍等以殺滅菊酯（見圖2）為研究對(duì)象，用GC-MS方法測(cè)定其降解產(chǎn)物以推斷擬除蟲菊酯的降解機(jī)理，發(fā)現(xiàn)殺滅菊酯經(jīng)酶降解12 h后得到C和D兩種產(chǎn)物，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖3所示，但24 h后不再檢測(cè)到C和D，說(shuō)明這兩種產(chǎn)物是殺滅菊酯降解的中間體[10]。李時(shí)銀等以氰戊菊酯為研究對(duì)象，采用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)氰戊菊酯及其水解產(chǎn)物進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在277 nm處吸收強(qiáng)度顯示出明顯差異，產(chǎn)生一定減色效應(yīng)，因此，推斷酯鍵斷裂后產(chǎn)生的產(chǎn)物中苯環(huán)上電子的共軛能力小于氰戊菊酯原藥[11]。Mandar等運(yùn)用GC-MS分析丙烯菊酯降解機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，該農(nóng)藥降解48 h后主要生成化合物1[2-Ethyl-1，3-dimethyl cyclopent-2-ene-carboxylic acid]、化合物2[Cyclopropanecarboxylic acid 2， 2-dimethyl-3-（2-methyl-1-propenyl）]和化合物 3[2-Propanal（1，1-dimethyl ethyl）-methyl]等，72 h后化合物3消失[12]。綜上所述，采用儀器分析法已基本確定酯酶催化酯鍵斷裂是擬除蟲菊酯農(nóng)藥的酶水解機(jī)制，但在水解產(chǎn)物及中間產(chǎn)物問題上目前仍無(wú)統(tǒng)一定論。

圖2 殺滅菊酯結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of fenvalerate

圖3 化合物C和D的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of compounds C and D

采用儀器分析降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)無(wú)法對(duì)酶催化降解機(jī)理進(jìn)行深入理論性探討。近年來(lái)，有學(xué)者開始采用量子化學(xué)法研究擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解機(jī)理，但仍處于起步階段。2007年褚嘉杰采用量子化學(xué)的方法，用計(jì)算機(jī)模擬化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，研究擬除蟲菊酯的降解反應(yīng)機(jī)理[13]。運(yùn)用密度泛函理論，在3LYP/6-31G*水平上建立計(jì)算方法，以氰戊菊酯為研究對(duì)象，多方面考察反應(yīng)過(guò)程中舊鍵斷裂和新鍵形成的細(xì)節(jié)，發(fā)現(xiàn)降解過(guò)程中，氰戊菊酯的C（1）=O（2）羰鍵逐漸變?nèi)酰珻（1）=O（31）之間形成弱單鍵，形成過(guò)渡態(tài)；隨之，過(guò)渡態(tài)的C（1）-O（3）鍵斷裂，同時(shí)C（1）-O（31）之間成鍵，完成雙分子親核取代反應(yīng)，得到醇羥基和羧酸產(chǎn)物。

2 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶的研究

2.1 降解酶的選取

由于酶在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解過(guò)程中起關(guān)鍵作用，研究一直試圖從微生物菌株、昆蟲、動(dòng)物及人體內(nèi)尋求高效酯酶，從而對(duì)擬除蟲菊酯進(jìn)行有效降解。

2.1.1 來(lái)源于菌株提取的降解酶

氯菊酯酶是90年代初研究較多的擬除蟲菊酯降解酶，主要從蠟狀芽孢桿菌中提取獲得。采用該酶在最優(yōu)條件下對(duì)2 mL 26 μmol·L-1氯菊酯進(jìn)行降解，降解速率較低，僅為0.352～0.235 nmol·min-1·mg-1·protein，效果不佳。繼而發(fā)現(xiàn)從某些菌株體內(nèi)分離出來(lái)的粗酶液可用于降解擬除蟲菊酯。洪永聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌TR2粗酶液對(duì)氯氰菊酯的降解率較高，在最佳條件下作用20 min，降解率可達(dá)84.6%[14]。解開治等對(duì)一株能高效降解擬除蟲菊酯的惡臭假單胞菌XP12進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)從中提取出來(lái)的粗酶液在pH 6.5～8.0時(shí)，對(duì)高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯的降解率為70%，在葉類蔬菜上試驗(yàn)其對(duì)擬除蟲菊酯的降解效果，降解率可達(dá)80%以上[15]。

目前國(guó)內(nèi)已有較多關(guān)于從微生物菌株中提取擬除蟲菊酯降解酶的研究報(bào)道。多數(shù)是對(duì)降解酶的分離提取、物理化學(xué)屬性等進(jìn)行一些基礎(chǔ)性研究，對(duì)于降解酶在土壤、污水處理或果蔬農(nóng)殘降解等方面的具體應(yīng)用卻較少提及，有待進(jìn)一步研究。

2.1.2 來(lái)源于昆蟲體內(nèi)提取的降解酶

昆蟲體內(nèi)對(duì)擬除蟲菊酯的代謝解毒作用是其產(chǎn)生抗性的主要原因，昆蟲體內(nèi)含有多種羧酸酯酶，因此，在研究從菌株中分離降解酶的同時(shí)，有學(xué)者從抗性昆蟲入手，研究昆蟲體內(nèi)某些對(duì)擬除蟲菊酯有催化降解作用的酯酶。蘭亦全等研究甜菜夜蛾對(duì)氰戊菊酯與順式氯氰菊酯的抗性機(jī)理，發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶活性提高是甜菜夜蛾對(duì)菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因之一，甜菜夜蛾抗溴氰菊酯品系對(duì)溴氰菊酯的降解速率是敏感品系的17倍[16]。Peter等從蜱幼蟲的組織勻漿中提取并純化出一種羧酸酯酶，能夠水解反式氯菊酯[17]。Lien等發(fā)現(xiàn)從蟑螂、家蠅、馬利筋蟲體內(nèi)提取出來(lái)的酯酶能夠水解芐呋菊脂和胺菊酯的正反異構(gòu)體，但不能水解右旋反式炔丙菊酯，在水解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)對(duì)反式異構(gòu)體的降解比順式異構(gòu)體更快[18]。因此可將抗性昆蟲產(chǎn)生的高活性酶制成藥劑，用于治療人體擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中毒。

2.1.3 來(lái)源于動(dòng)物與人體內(nèi)提取的降解酶

從菌體、昆蟲體內(nèi)提取新酶源對(duì)擬除蟲菊酯進(jìn)行降解取得一定效果。然而動(dòng)物與昆蟲相比，對(duì)擬除蟲菊酯的敏感度更低，這是由于動(dòng)物的代謝速度高、體溫較高、以及離子通道靶點(diǎn)的敏感性較低所致。不少學(xué)者致力于研究動(dòng)物體內(nèi)擬除蟲菊酯的代謝途徑，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)含有多種羧酸酯酶，一般以肝臟、血清和腦組織中的酯酶活性較高，這些羧酸酯酶對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解起重要作用。有試驗(yàn)證明小鼠肝臟中的菊酯水解酶活力要高于昆蟲[18]。張慧君等發(fā)現(xiàn)雞肝酯酶是一種廣譜性酯酶，酶活力與乙酰膽堿酯酶相近，是一種能夠催化擬除蟲菊酯水解的B酯酶[19-20]。Syed等發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織勻漿中含有一種或多種羧酸酯酶，能夠水解反式菊酯[21]。該酶對(duì)反式菊酯的親和力比小鼠肝臟內(nèi)羧酸酯酶的親和力高，但最大水解速度卻低于后者。氰戊菊酯與鯽魚肝胰組織中的磷酸單酯水解酶活性具有劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，因此該酶還可用作魚體受農(nóng)藥污染的標(biāo)記物[22]。

人體對(duì)擬除蟲菊酯的代謝途徑與哺乳動(dòng)物相似，人體肝臟中含有羧酸酯酶hCE-1和hCE-2，在水解I型和II型除蟲菊酯時(shí)具有很強(qiáng)的立體選擇性，例如這兩種酯酶水解氯菊酯和氯氰菊酯的反式異構(gòu)體比順式異構(gòu)體更快。hCE-2雖能水解反式氯菊酯，但不能水解溴氰菊酯和芐呋菊脂[23]。因此特異性強(qiáng)的酯酶不僅是水解擬除蟲菊酯的關(guān)鍵酶，還可以用來(lái)作為某些特定菊酯的靶標(biāo)酶。

2.2 降解酶的純化與固定化

降解酶的來(lái)源是影響農(nóng)藥降解率的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)，酶的純度及活性對(duì)農(nóng)藥降解率有一定作用。

針對(duì)粗酶中所含雜質(zhì)會(huì)對(duì)水解反應(yīng)造成影響，對(duì)降解酶進(jìn)行分離純化，以提高降解速率。林淦等從惡臭假單胞菌CP-1中提取粗酶，以0.005 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4溶液為洗脫液，經(jīng)陰陽(yáng)離子交換層析兩步純化酯酶，結(jié)果表明，降解活力由最初的15.0 U·mg-1分別提高到55.4和85.0 U·mg-1，且回收率達(dá)到90%，達(dá)到預(yù)期目的[24]。

采用固定化技術(shù)提高游離酶穩(wěn)定性。酶的固定化是將游離酶固定于某一載體上，以提高酶的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)降解效果。但固定后酶活性會(huì)部分降低。有學(xué)者采用凝膠或離子交換樹脂等作為擬除蟲菊酯降解酶的固定化材料，已取得較好效果[25-27]。納米材料應(yīng)用于其他農(nóng)藥降解酶的固定化已有多篇報(bào)道，但用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶固定化的文獻(xiàn)尚未見到。納米材料在酶的固定化應(yīng)用上已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)，探索用于擬除蟲菊酯降解酶的固定化具有一定的前景，也是提高酶降解率的有效方法之一。

3 酶催化擬除蟲菊酯水解的條件優(yōu)化研究

酶催化擬除蟲菊酯水解過(guò)程中，控制好水解反應(yīng)的條件如反應(yīng)溫度、pH等因素也是提高降解率的重要保證。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酶參與水解擬除蟲菊酯的反應(yīng)條件展開一系列研究。Maloney等從蠟狀芽孢桿菌提取氯菊酯酶用于降解擬除蟲菊酯，研究發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)溫度37℃、pH 7.0條件下活性最強(qiáng)，但是降解擬除蟲菊酯的速率較低，水解效果不明顯[28]。虞云龍等從YFI1菌株提取出粗酶液，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其在30～34℃、pH 6.0～9.5范圍內(nèi)對(duì)殺滅菊酯和氯菊酯均具有降解活性。在最佳反應(yīng)條件32.5℃、pH 8.0時(shí)對(duì)殺滅菊酯顯示最大的降解活性，最大降解速率為211.8 nmol·min-1·mg-1·protein，米氏常數(shù)為41.4 nmol·mL-1；對(duì)氯菊酯的降解在32.5℃、pH 9.0時(shí)顯示最大活性，最大降解速率為20.8 nmol·min-1·mg-1·protein，米氏常數(shù)為 5.2 nmol·mL-1，與其他反應(yīng)條件相比顯示出較好的降解效果[29-30]。由于酯鍵在堿性環(huán)境下更容易發(fā)生水解反應(yīng)，多數(shù)擬除蟲菊酯酶水解應(yīng)控制在偏堿性條件下進(jìn)行，但應(yīng)當(dāng)同時(shí)考慮降解酶的適應(yīng)條件。

對(duì)于降解菌中提取的降解酶，除考慮以上因素外，還應(yīng)當(dāng)考慮底物濃度、菌量以及有機(jī)、無(wú)機(jī)物質(zhì)等影響。劉麗花等從海洋沉積物中篩選到一株能夠高產(chǎn)降解溴氰菊酯降解酶的菌株，并發(fā)現(xiàn)該菌株在以可溶性淀粉為碳源、蛋白胨與酵母浸膏質(zhì)量比2∶1為氮源、pH 7.5、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間2 d、接種量3%的最適產(chǎn)酶條件下，對(duì)15 μmol·L-1溴氰菊酯降解率達(dá)54.6%[31]。Grant等從使用擬除蟲菊酯的菜園和農(nóng)田土壤的混合土樣中分離出熒光假單胞菌和普城沙雷菌，用這兩種菌株處理含有氯氰菊酯的綿羊蘸洗液，并在25℃、80r·min-1條件下培養(yǎng)14d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)250mg·L-1氯氰菊酯去除率約66.7%[32-33]。水解條件的優(yōu)化研究對(duì)菜園、農(nóng)田土壤中的擬除蟲菊酯降解具有重要意義。

4 小結(jié)與展望

酶催化擬除蟲菊酯類農(nóng)藥水解能夠有效地降解農(nóng)藥，相比其他降解方法如光降解、氧化降解，酶水解具有高效專一、安全、成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的發(fā)展前景。在水解過(guò)程中，酶起關(guān)鍵作用，因此對(duì)催化擬除蟲菊酯類農(nóng)藥水解的酶進(jìn)行深入研究，探尋酶的結(jié)構(gòu)與活力之間的關(guān)系，并對(duì)酶進(jìn)行生物改造，這不僅有助于提高酶的降解活力，提高哺乳動(dòng)物或人體內(nèi)對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解速率，更有助于今后開發(fā)更有效、安全、易降解的菊酯類農(nóng)藥。目前對(duì)參與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥水解的酶（主要是羧酸酯酶）的研究，多數(shù)是在對(duì)菌體和昆蟲體內(nèi)提取出的酶的生化特性進(jìn)行描述，而哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取酶的研究較少，對(duì)羧酸酯酶的基礎(chǔ)性研究也有待加強(qiáng)，這將成為未來(lái)要深入研究的目標(biāo)之一。

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