廣州一號(hào)桉樹高效組培再生體系的建立1)

歐陽樂軍 沙月娥 黃真池 曾富華

(湛江師范學(xué)院，湛江，524048)

桉樹是世界三大速生樹種之一，共有1 039 個(gè)種、亞種和變種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界桉樹人工林面積超過2 000 萬hm2，是世界公認(rèn)的三大人工林樹種之一［1］。中國引種桉樹已有120 a 歷史，在17 個(gè)省(區(qū))種植，每年新營造桉樹林達(dá)33 萬hm2，2011年，我國桉樹人工林面積已達(dá)到368 萬hm2，占全國人工林面積的6%以上，年生產(chǎn)木材近4 000 萬m3，占國內(nèi)自主生產(chǎn)紙漿材的50%以上，是我國重要的經(jīng)濟(jì)林樹種［2］。廣州一號(hào)桉是尾葉桉(E. urophylla)與細(xì)葉桉(E. tereticornis)的雜交種，具有速生豐產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，但由于不定芽分化率低，種苗快繁困難，生產(chǎn)上尚未能大面積推廣，關(guān)于廣州一號(hào)桉組織培養(yǎng)再生體系的研究也未見報(bào)道。

本試驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上［3］，利用噻唑基脲類新型分裂素(N－phenyl－N'－［6－(2－chlorobenzothiazol)－yl］urea，PBU)誘導(dǎo)廣州一號(hào)桉高分化潛能的愈傷組織形成和不定芽分化增殖，使不定芽分化率達(dá)到90%，生根率為100%，并通過移栽方法優(yōu)化，使組培苗移栽成活率達(dá)到95%，建立了廣州一號(hào)桉高效組織培養(yǎng)再生體系。為生產(chǎn)上廣州一號(hào)桉大規(guī)模商品化育苗提供一定的參考，也為廣州一號(hào)桉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試材料為湛江市林業(yè)科學(xué)研究所提供的廣州一號(hào)桉無菌苗，挑取粗壯的幼苗，將其嫩莖切成0.5 ～0.8 cm 長的不帶芽點(diǎn)的莖段作為外植體。

PBU 由廣東高校邊緣熱帶特色植物工程技術(shù)開發(fā)中心李再峰等［4］合成，先將PBU 溶于少量二甲基甲酰胺，再加水定容至質(zhì)量濃度為100 mg·L－1母液備用;2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)、吲哚－3－丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、6－芐基腺嘌呤(6－BA)、亞精胺(Spd)、腐胺(Put)、維生素C(Vc)、N－苯基－N'－1，2，3－噻二唑－5－脲(TDZ)均購置于生工生物工程(上海)有限公司，基本培養(yǎng)基采用MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度約32.5 μmol·m－2·s－1，光照時(shí)間12 h·d－1。

愈傷組織誘導(dǎo):將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基(MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，添加不同質(zhì)量濃度的TDZ 與2，4－D 組合以及PBU 與IAA 組合，pH 值為5.8 ～6.0)上，于(25±2)℃下暗培養(yǎng)14 d，再光暗交替培養(yǎng)7 d 后計(jì)算愈傷組織形成情況及誘導(dǎo)率。

不定芽的分化:將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基(MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc+2 mg·L－1PBU+0.06 mg·L－1IAA，pH值為5.8 ～6.0)上，經(jīng)暗培養(yǎng)14 d、光暗交替培養(yǎng)7 d 后，再將外植體接種于不定芽分化培養(yǎng)基(1/2MS+500 μmol·L－1Put+100 μmol·L－1Spd+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，添加不同質(zhì)量濃度梯度的6－BA 和NAA 組合、6－BA 和IAA 組合，pH 值為5.8 ～6.0)上，40 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況和不定芽誘導(dǎo)率。同時(shí)，分別用2 mg·L－1PBU 和0.06 mg·L－1IAA 組合、1.0 mg·L－12，4－D 與0.05 mg·L－1TDZ 組合(對(duì)照)誘導(dǎo)的兩種愈傷組織作不定芽誘導(dǎo)率的比較，統(tǒng)計(jì)2 種不同激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織在相同的不定芽誘導(dǎo)條件下(激素組合為1 mg·L－16－BA 和0.1 mg·L－1NAA)，不定芽誘導(dǎo)情況的差異。

不定芽的增殖與伸長:將高約0.5 cm 且長勢(shì)較好的芽叢切割成單株，保留部分愈傷組織基部，轉(zhuǎn)移到不定芽伸長培養(yǎng)基(1/2MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，添加不同質(zhì)量濃度梯度的PBU 與NAA 組合，pH 值為5.8 ～6.0)上培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)不定芽伸長情況。

不定芽的生根:將高為3 ～4 cm 的無菌苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，分別添加不同質(zhì)量濃度梯度的IBA、IAA 以及NAA，pH 值為5.8 ～6.0)中，培養(yǎng)20 d 后統(tǒng)計(jì)生根情況及生根率(即生根苗數(shù)占總苗數(shù)的百分率)。

煉苗與移栽:將生根良好的生根苗分成3 組，分別從恒溫光照培養(yǎng)箱移至室外自然環(huán)境中分別煉苗10、15、20 d。挖取黃心土(山地紅壤)、腐殖質(zhì)土，分別以質(zhì)量m(黃心土)∶m(腐殖質(zhì)土)=1 ∶1、m(黃心土)∶m(腐殖質(zhì)土)= 2 ∶1、m(黃心土)∶m(腐殖質(zhì)土)=3 ∶1 3 種基質(zhì)裝于花盆當(dāng)中，澆透水，將煉苗后的生根苗移栽至上述3 種基質(zhì)中，20 d 后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的每個(gè)試驗(yàn)處理均設(shè)置5 個(gè)重復(fù)的培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20 個(gè)外植體，外植體愈傷組織以切口基部能觀察到球狀突起，即生長出直徑大于2 mm 的愈傷組織計(jì)數(shù)，愈傷組織誘導(dǎo)率為生長愈傷組織外植體占接種外植體數(shù)的百分比。不定芽分化率以愈傷組織表面生長出大于4 mm 芽點(diǎn)的愈傷組織數(shù)占接種愈傷組織數(shù)的百分比［5］。不定芽伸長、生根及移栽的每個(gè)處理均設(shè)置5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 個(gè)單株。數(shù)據(jù)利用SAS 分析軟件進(jìn)行處理，文中百分率數(shù)據(jù)分析時(shí)經(jīng)過正弦平方根轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織形成的影響

外植體在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 ～10 d，切口兩端陸續(xù)開始產(chǎn)生愈傷組織，外植體呈啞鈴狀，以后逐漸從兩端延伸形成膨大的愈傷組織。在光下培養(yǎng)1 周后，愈傷組織逐漸變?yōu)榫G色，產(chǎn)生芽點(diǎn)(圖1A)。

由表1可知，2，4－D 與TDZ 組合、PBU 與IAA組合，都能誘導(dǎo)愈傷組織形成，同一組合的不同質(zhì)量濃度處理間愈傷組織誘導(dǎo)率差異達(dá)到極顯著水平。PBU 與IAA 組合處理下的愈傷組織誘導(dǎo)率比2，4－D 與TDZ 組合高，愈傷組織形成快，結(jié)構(gòu)較致密，在后續(xù)不定芽誘導(dǎo)中分化能力更好。當(dāng)PBU 質(zhì)量濃度為2 mg·L－1，IAA 質(zhì)量濃度為0.06 mg·L－1時(shí)，5 d 后愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)到100%。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽分化的影響

由表2可知，同一植物生長調(diào)節(jié)劑組合的不同質(zhì)量濃度處理間不定芽誘導(dǎo)率差異達(dá)到極顯著水平。在6－BA 和IAA 的組合中，誘芽率較低，最高誘導(dǎo)率僅為46%，且不定芽生長情況一般。6－BA 和NAA 的組合中，當(dāng)6－BA、NAA 的質(zhì)量濃度分別為1.0、0.10 mg·L－1時(shí)，誘芽率達(dá)到最大，為90%，生長狀況好，30 d 后每塊愈傷組織能產(chǎn)生約20 個(gè)小芽(圖1B、C)。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽分化的影響

為了進(jìn)一步探究用PBU 誘導(dǎo)的愈傷組織對(duì)后續(xù)誘芽率的影響，分別用2 mg·L－1PBU 和0.06 mg·L－1IAA 組合、1. 0 mg·L－12，4－D 與0. 05 mg·L－1TDZ 組合(作對(duì)照)誘導(dǎo)的2 種愈傷組織作誘芽率的比較，結(jié)果表明，在相同的不定芽誘導(dǎo)條件下，經(jīng)PBU 誘導(dǎo)的愈傷組織平均誘芽率達(dá)到90.0%，而對(duì)照處理的誘芽率則只有49.6%，經(jīng)t 檢驗(yàn)，差異達(dá)到極顯著水平。

2.3 不同質(zhì)量濃度NAA 和PBU 組合對(duì)不定芽伸長的影響

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的所有植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)芽伸長高度的差異很大，從0.5 ～5 cm 不等(表3)。在低質(zhì)量濃度的NAA 誘導(dǎo)下，不定芽增殖較多，明顯影響到芽伸長的效率;當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.05 mg·L－1，PBU 質(zhì)量濃度為0.2 mg·L－1時(shí)，不定芽有3 ～5 cm 的明顯伸長，葉片綠色，芽苗生長情況較好(圖1D)。

2.4 不同質(zhì)量濃度的植物生長素對(duì)生根的影響

將3 cm 左右高的叢生芽切成單株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，6 d 后在莖基部開始膨大，并有白色根點(diǎn)突起，9 ～15 d 后陸續(xù)長根，根由莖直接發(fā)出，無愈傷組織形成(圖1E)。

如表4可見，不同質(zhì)量濃度的3 種植物生長素誘導(dǎo)生根率差異較大，經(jīng)方差分析達(dá)到極顯著水平。當(dāng)IBA 質(zhì)量濃度為0.2 mg·L－1時(shí)，生根率最高可達(dá)100%，且生根時(shí)間短，根粗壯，根系發(fā)達(dá);其次是IAA，生根誘導(dǎo)率最高也可達(dá)80%以上。而3 種質(zhì)量濃度的NAA 誘導(dǎo)生根的效果均不是很好，誘導(dǎo)率均沒有超過40%。

表3 不同質(zhì)量濃度的NAA 和PBU 組合對(duì)不定芽伸長的影響

表4 不同質(zhì)量濃度的生長調(diào)節(jié)劑對(duì)生根的影響

2.5 煉苗時(shí)間及移栽基質(zhì)對(duì)生根苗移栽成活率的影響

從表5及表6中可知，不同煉苗時(shí)間以及移栽基質(zhì)對(duì)廣州一號(hào)桉生根苗移栽成活率影響較大。煉苗天數(shù)為15 d時(shí)成活最高，為95% 。移栽基質(zhì)中m(黃心土)∶m(腐殖質(zhì)土)= 1 ∶1 時(shí)，移栽后成活率最高，為95%，且長勢(shì)也最好(圖1F)。

表5 不同煉苗時(shí)間及移栽基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響

表6 不同移栽基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響

圖1 廣州一號(hào)桉樹再生過程

3 結(jié)論與討論

桉樹是多年生木本植物，其細(xì)胞返幼狀態(tài)差，難以脫分化，也難于分化成芽，外植體也極易褐化，因此，在組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化均有較大難度，特別是廣州一號(hào)桉是公認(rèn)的一種不定化分化困難、快繁系數(shù)低、組培種苗生產(chǎn)成本高的桉樹雜交樹種。本實(shí)驗(yàn)室利用PBU 和其他植物生長調(diào)節(jié)劑組合來誘導(dǎo)尾葉桉、尾巨桉、粗皮桉等桉樹樹種的愈傷組織，結(jié)果表明，PBU 能極大地提高愈傷組織誘導(dǎo)率，且活力更好，更有利于后續(xù)培養(yǎng)中不定芽的分化［6－8］。在本研究中，PBU 比6－BA 更利于尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)，可能是因?yàn)镻BU 是在N－取代苯基－N－(6－苯并噻唑基)脲類化合物的基礎(chǔ)上，以2－硝基氯苯取代苯胺為原料，合成的脲類化合物，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，再加上IAA 的協(xié)同作用，誘導(dǎo)率明顯升高，使愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100%。特別是愈傷組織活力較好，分化潛力強(qiáng)，在后續(xù)的不定芽誘導(dǎo)中，不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)90%，比未經(jīng)PBU 誘導(dǎo)形成的愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率高出近40%，差異達(dá)到極顯著水平，說明PBU 誘導(dǎo)形成的愈傷組織在后續(xù)培養(yǎng)中更有利于不定芽的分化。

在誘導(dǎo)不定芽的分化時(shí)，有部分學(xué)者采用KT誘導(dǎo)不定芽分化，因KT 作為一種具有很強(qiáng)的分裂素活性，能力較6－BA 強(qiáng)［9］，大部分學(xué)者都采用6－BA 和NAA 2 種激素進(jìn)行配比［10－11］，結(jié)果證明不同質(zhì)量濃度的6－BA 對(duì)桉樹不定芽的誘導(dǎo)影響很大，本研究結(jié)果也表明，6－BA 1.0 mg·L－1與NAA 0.06 mg·L－1組合誘導(dǎo)廣州一號(hào)桉不定芽形成的比率可達(dá)到90%，初步分析認(rèn)為，促進(jìn)細(xì)胞分裂能力相對(duì)較溫和的6－BA，能改善細(xì)胞內(nèi)源生長素和細(xì)胞分裂素的比例，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化狀態(tài)，有利于促進(jìn)芽的分化，抑制根的分化。而KT 促進(jìn)細(xì)胞分裂能力過強(qiáng)，不適于芽分化前期的愈傷生長，容易造成褐化。

在廣州一號(hào)桉組培苗培育過程中，長時(shí)間的高濕度生長環(huán)境影響了組培苗葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)，如角質(zhì)層變薄、氣孔調(diào)節(jié)失靈，加之組培苗的營養(yǎng)主要從培養(yǎng)基中獲得，光合作用效率低下，從而導(dǎo)致組培生根苗在移栽后，散失的水分多于吸收的水分，對(duì)外界環(huán)境的變化所做出的反應(yīng)也相應(yīng)較大，移栽成活變得更加因難。本試驗(yàn)中通過對(duì)煉苗時(shí)間及移栽基質(zhì)的優(yōu)化，使移栽成活率高達(dá)95%。本研究發(fā)現(xiàn)，煉苗時(shí)間太短，組培苗難以適應(yīng)外界環(huán)境;時(shí)間太長培養(yǎng)基易染菌，加之培養(yǎng)基消耗時(shí)間過長，營養(yǎng)不足，影響組培苗的生長，煉苗時(shí)間以15 d 為宜，多數(shù)組培苗植株葉片舒展，呈墨綠色，莖木質(zhì)化程度好，根系發(fā)育正常，移栽成活率大為提高。同時(shí)，在移栽的腐殖質(zhì)土中添加一定比例的黃心土，黃心土可以使組培苗染菌的機(jī)率大大降低，而腐殖質(zhì)土則可使移栽基質(zhì)疏松透氣且富含豐富的有機(jī)質(zhì)，提高移栽成活率，促進(jìn)幼苗的快速生長。

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