甘薯羽狀斑駁病毒外殼蛋白基因的分子變異

王曉華， 張振臣，2＊， 喬 奇，2， 秦艷紅，2， 張德勝，2， 田雨婷，2

（1．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，鄭州 450002； 2．河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點實驗室，鄭州 450002）

甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato f eather y mottle vir us，SPFMV）是侵染甘薯的主要病毒之一，分布于世界各甘薯產(chǎn)區(qū)。SPFMV屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvir us），基因組為單鏈正義RNA，可經(jīng)蚜蟲、摩擦和嫁接方式傳播［1］。SPF MV可與甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chl or otic stunt vir us，SPCSV）協(xié)生共侵染甘薯引起SPVD（sweet potato vir us disease），SPVD是甘薯上的一種毀滅性病害。甘薯感染SPVD后，減產(chǎn)可達(dá)50%～98%，甚至絕收［2］。根據(jù)SPFMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因的核苷酸序列以及在甘薯和鑒別寄主上的癥狀類型，SPFMV至少可劃分為RC、O、C和EA 4個株系［3］。目前，侵染我國甘薯的SPFMV的分子變異及株系類型尚未見報道。單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single－strand confor mation poly morphis m，SSCP）分析技術(shù)是基于PCR、以構(gòu)象為基礎(chǔ)檢測基因組中核苷酸變異的方法，已應(yīng)用于植物病毒分子變異研究［4］。本研究以采自我國主要甘薯產(chǎn)區(qū)11個省份的病毒樣品為材料，應(yīng)用SSCP技術(shù)結(jié)合核苷酸序列測定的方法，對SPFMV CP基因的分子變異情況進(jìn)行了分析，初步明確了這些地域的SPFMV的株系類型，可為該病毒的預(yù)警和控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 病毒樣品的采集

2009－2010年，分別從我國11個?。ㄊ校┎杉?0份具有典型病毒病癥狀的甘薯植株樣品（表1），樣品采回后種植于防蟲溫室內(nèi)，成活后嫁接于健康巴西牽牛植株上。取甘薯葉片或?qū)?yīng)嫁接發(fā)病的巴西牽牛葉片作為供試樣品。

表1 不同分離物的SSCP圖譜類型及其數(shù)目

1．1．2 酶及試劑（盒）

Flash UNIQ－10柱式 總 RNA 抽提 試劑盒、IPTG、氨芐青霉素（Amp）、X－gal、丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、N，N′－亞甲基雙丙烯酰胺、硼酸和過硫酸銨均購自上海生工生物工程有限公司；去離子甲酰胺、二甲苯氰FF、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Mar ker、RT－PCR試劑盒（Ta Ka Ra RNA PCR Kit，A MV Ver．3．0）和p MD19－T載體購自 Ta Ka Ra公司；大腸桿菌（Escherichia coli）J M109系本實驗室保存；DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中登錄的SPFMV核苷酸序列，設(shè)計一 對 簡 并 引 物 P5（5′－TATGAC （A／G）CACTTCAGTGACGTTGCTGA－3′）和 P3（5′－GACTCTCGAGCCTATTGCACACCCCT CATTCC－3′），用于擴(kuò)增SPFMV的CP基因片段，引物由上海生工生物工程有限公司合成。目的片段大小為328 bp。

1．2．2 RT－PCR

利用上海生工生物工程有限公司的Flash UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒提取感病葉片的總RNA。以提取病葉總RNA為模板，利用P5和P3引物以及Ta Ka Ra公司的RT－PCR試劑盒（Ta Ka Ra RNA PCR Kit，AMV Ver．3．0）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，方法參照試劑盒說明書。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)。1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1．2．3 SSCP分析

SSCP分析參考魏太云等［5］的方法。取PCR產(chǎn)物2μL，加8μL上樣緩沖液（95%去離子甲酰胺、0．5%溴酚藍(lán)、0．5%二甲苯氰FF），混勻后在95℃中變性10 min，取出后立即冰浴5 min，然后全部上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶二甲叉雙丙烯酰胺＝30∶0．8）。在4℃冰箱中電泳，首先在200 V電壓下電泳5 min，然后100 V恒壓電泳3 h，EB染色30 min觀察結(jié)果。

1．2．4 PCR產(chǎn)物的克隆和序列測定

將純化后的PCR產(chǎn)物與p MD19－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆。核苷酸序列測定由Ta Ka Ra公司完成。利用DNA MAN和MEGA4．0軟件對所測序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 SPFMV CP基因的SSCP分析

從供試的50份樣品中均擴(kuò)增出了目的條帶，SSCP分析結(jié)果表明，分析的各分離物至少有9種圖譜類型（圖1）。大多數(shù)樣品集中分布在3種圖譜類型中，其中有15個樣品表現(xiàn)為圖譜類型A，12個樣品表現(xiàn)為圖譜類型B，11個樣品表現(xiàn)為圖譜類型D，其他樣品顯示另外6種SSCP圖譜類型（表1）。根據(jù)圖譜條帶的帶形分布可大致分為4組，其中A、C、I為第1組（groupⅠ），B、E、F、H 為第2組（groupⅡ），D為第3組（groupⅢ），G為第4組（groupⅣ）。

圖1 SPFMV不同分離物CP基因RT－PCR產(chǎn)物的SSCP分析

2．2 SPFMV不同分離物CP基因的序列分析

對顯示不同帶型的部分樣品的CP基因進(jìn)行了克隆和序列測定（表2），共測定了20個分離物的CP基因，結(jié)果表明，不同分離物CP基因的核苷酸序列一致性為77．2%～99．9%，說明侵染我國甘薯的SPFMV的CP基因存在較大的分子變異。選取Gen Bank中登錄的SPFMV 4個株系（O、C、EA和RC）有代表性的核苷酸序列，與本研究測定的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析（圖2），發(fā)現(xiàn)20個分離物也明顯分為4個組，與SSCP的分析結(jié)果基本一致，說明我國的SPFMV至少存在4個不同的株系類型。

表2 用于進(jìn)化樹分析的病毒樣品及其SSCP圖譜類型

圖2 不同SPFMV分離物CP基因的進(jìn)化樹分析

3 討論

本文利用PCR－SSCP的方法研究了我國甘薯主產(chǎn)區(qū)11個省份的SPFMV的分子變異和株系分化情況。SSCP分析結(jié)果表明，不同地區(qū)的分離物表現(xiàn)較豐富的圖譜類型，說明各分離物之間存在序列差異。核苷酸序列測定結(jié)果證明了不同分離物CP基因的核苷酸序列一致性為77．2%～99．9%，根據(jù)Potyvir us病毒劃分種的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時，應(yīng)歸為同一個種［6］，顯然，這些不同地區(qū)的分離物均為SPF MV。根據(jù)CP基因核苷酸序列的進(jìn)化樹分析可以發(fā)現(xiàn)，SPF MV存在4個明顯不同的株系，這是我國關(guān)于SPFMV株系研究的首次報道。對比序列測定結(jié)果和SSCP分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒RNA序列差異與SSCP圖譜之間并沒有簡單對應(yīng)關(guān)系，例如，分離物Jiangsu－4與Henan－1的圖譜類型相似，同屬第2組，但兩個分離物CP基因的核苷酸序列一致性僅為78．0%，分別屬于C株系和EA株系；相反，分離物Anhui－1與Jiangsu－4為同一株系，但兩者的SSCP圖譜又不相同，說明SSCP并不能完全保證對不同分離物序列之間微小差異的檢測［7］，精確的分子變異分析，需要核苷酸序列測定進(jìn)行驗證。

［1］ 張振臣，李大偉，陳健夫，等．甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)及特異抗血清的制備［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2000，8（2）：177－179．

［2］ Gutiérrez，D L，F(xiàn)uentes S，Salazar L F．Sweet potato vir us disease（SPVD）：Distribution，incidence，and effecton sweet potato yield in Per u［J］．Plant Disease，2003，87：297－302．

［3］ Ya masaki S，Sakai J，F(xiàn)uji S，et al．Co mparisons a mong isolates of Sweet potato f eather y mottle vir us using complete geno mic RNA sequences［J］．Arch Vir ol，2010，155：795－800．

［4］ 魏太云，林含新，吳祖建，等．PCR－SSCP技術(shù)在植物病毒學(xué)上的應(yīng)用［J］．福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，29（2）：181－186．

［5］ 魏太云，林含新，吳祖建，等．水稻條紋葉枯病毒NS2基因遺傳多樣性分析［J］．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2003，19（5）：600－605．

［6］ Untiver os M，F(xiàn)uentes S，Kreuze J．Molecular variability of Sweet potato f eather y mottle vir us and other potyvir uses infecting sweet potato in Peru［J］．Arch Virol，2008，153：473－483．

［7］ 施農(nóng)農(nóng)，陳劍平，Ada ms M J．中國大麥黃花葉病毒分離物的分子變異［J］．病毒學(xué)報，1999，15（4）：339－347．