柑橘潰瘍病菌快速診斷膠體金速測(cè)卡的研制

殷幼平， 吳瑜佳， 于 紅， 李 蒙， 王中康

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院基因研究中心，重慶 400030）

柑橘潰瘍?。–itr us bacterial canker disease，CBCD）是一種由柑橘黃單胞菌（Xanthomonas citri pv．citri，Xcc）所引起的，危害全世界柑橘種植業(yè)最嚴(yán)重的檢疫性細(xì)菌病害［1］。該病能侵染多種蕓香科植物，包括柑橘屬的絕大多數(shù)商品化栽培品種。此病主要隨罹病種苗等繁殖材料遠(yuǎn)距離傳播，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)往往導(dǎo)致樹勢(shì)衰退，枯枝落葉、果實(shí)上布滿病斑、品質(zhì)變劣甚至未熟先落，嚴(yán)重影響柑橘的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于抗病品種和特效藥劑的匱乏，對(duì)于感病植株仍然沿用挖除病樹集中燒毀的鏟除方法。目前對(duì)該病的防控主要依靠加強(qiáng)植物檢疫檢測(cè)，早期診斷病害，切斷傳播途徑。目前，常用的針對(duì)柑橘潰瘍病的檢測(cè)方法主要包括免疫檢測(cè)和分子檢測(cè)，免疫檢測(cè)主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和斑點(diǎn)免疫結(jié)合法（DIA），分子檢測(cè)主要包括常規(guī)PCR檢測(cè)和熒光定量 PCR檢測(cè)［2－3］，其中 ELISA 檢測(cè)和 DIA檢測(cè)操作步驟繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，常規(guī)PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)雖然靈敏度較高，但需要專門的儀器設(shè)備，這幾種檢測(cè)方法都無法適應(yīng)基層檢驗(yàn)檢疫部門的需要。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，柑橘產(chǎn)品的調(diào)運(yùn)和交換更加頻繁，人為傳播的危險(xiǎn)性急劇加大，在這樣的形勢(shì)下迫切需要更加快速簡(jiǎn)便的病害現(xiàn)場(chǎng)診斷方法。膠體金免疫技術(shù)（ICG）是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物［4－6］，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在1～150 n m之間的金溶膠顆粒，依據(jù)顆粒大小的不同顏色呈橘紅色到紫紅色。膠體金顆粒能迅速而穩(wěn)定地吸附生物大分子，而不改變其生物活性，它可以作為探針進(jìn)行細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)精確定位；也可以用于日常的免疫診斷。其優(yōu)點(diǎn)是快速、靈敏、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且操作簡(jiǎn)便、無需任何儀器設(shè)備，結(jié)果判斷直觀可靠、易被基層人員掌握等。因而在電鏡［7－8］、免疫印跡［9－10］、體外診斷 試 劑 盒［11－13］的 制 造、藥 物 殘 留［14－16］、臨 床 診斷［17－18］等領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于植物病害檢測(cè)起步雖晚，但作為一種新型的免疫研究技術(shù)發(fā)展很快，具有極大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。利用膠體金示蹤結(jié)合電鏡技術(shù)探討植物病害感病致病機(jī)理方面：利用該方法研究過水稻內(nèi)生細(xì)菌、玉米矮花葉病毒、甜菜壞死黃脈病毒的侵染部位、葡萄扇葉病毒移動(dòng)蛋白、稻瘟病附著胞的形成和穿透過程［19－21］。在植物病害檢測(cè)方面，出現(xiàn)了黃龍病菌膠體金快速診斷試劑盒［22］；魏梅生［23－24］利用膠體金免疫層析法檢測(cè)馬鈴薯X病毒和馬鈴薯Y病毒以及煙草環(huán)斑病毒，隨后又進(jìn)一步開發(fā)銀加強(qiáng)法。本研究針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)難以應(yīng)用于基層、田間柑橘潰瘍病菌診斷的缺陷，利用重慶大學(xué)基因工程研究中心前期篩選的多克隆抗體、重組抗體，制備并比較單抗與它們實(shí)際應(yīng)用特性，在前期建立潰瘍病菌的膠體金快速診斷方法基礎(chǔ)上［25］，首次研發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的柑橘潰瘍病菌快速診斷膠體金速測(cè)卡，為柑橘潰瘍病菌的診斷提供一種簡(jiǎn)便、快速、特異、實(shí)用的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1．1 主要試驗(yàn)材料

重組抗體Xcc－dsf v工程菌株由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建［26－28］。堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠抗體、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG20000購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司。硝酸纖維素膜AE99、玻璃纖維膜Ahlstrom8964、純棉墊Rapid27及CF6均購自上海捷寧生物科技有限公司。

1．2 抗體制備

單克隆抗體制備工作主要由上海吉爾生化公司完成；重組抗體 Xcc－sc－dsfv為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建［22］；多克隆抗體采用Xcc菌懸液免疫家兔的抗血清提純所得。

1．3 抗體特性評(píng)價(jià)及篩選

對(duì)獲得的3類4株抗體：?jiǎn)慰寺】贵wXcc－2D6、Xcc－2D8；多克隆抗體 Xcc－pab2；重組抗體 Xcc－scdsf v，通過間接ELISA方法進(jìn)行特異性、靈敏度和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。最終篩選兩株最優(yōu)抗體進(jìn)行膠體金速測(cè)卡的研發(fā)。

1．3．1 特異性測(cè)試

采用抗原菌Xcc及10株供試菌種，均稀釋成A600＝0．5的菌懸液，采用間接ELISA方法分別包被96孔酶聯(lián)板上，1%BSA－PBS封閉后每孔加入100μL PBS稀釋的純化抗體，濃度10 ng／μL，37℃孵育1 h。洗脫后加入用PBS 1∶1000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗抗體，37℃孵育1 h［29］。p NPP顯色，酶標(biāo)儀405 n m讀數(shù)。分別測(cè)試幾種抗體與各個(gè)菌種的結(jié)合能力。該試驗(yàn)重復(fù)3次以保證結(jié)果的真實(shí)可靠。

1．3．2 靈敏度測(cè)試

將抗原菌Xcc菌懸液稀釋成A600＝0．5，分別將4株抗體用PBS按照1∶1000倍開始等比例稀釋到1∶256 000倍，采用上述相同的間接ELISA方法，分別測(cè)試4株抗體與抗原菌Xcc特異性結(jié)合的靈敏度。該試驗(yàn)重復(fù)3次以保證結(jié)果的真實(shí)可靠。

1．3．3 穩(wěn)定性測(cè)試

將分裝好的4株抗體（用PBS 1∶1000倍稀釋）于4℃冰箱中分別放置30、60、90、120、150、180 d后取出，間接ELISA方法測(cè)試各個(gè)時(shí)間段下4株抗體與抗原菌Xcc的結(jié)合能力。該試驗(yàn)重復(fù)3次以保證結(jié)果的真實(shí)可靠。

1．4 膠體金的制備

吸取濃度為1．67 mg／mL氯金酸原液6．11μL，加入100 mL超純水中配制成0．01%的氯金酸，在磁力攪拌器上加熱直至煮沸；迅速加入1．8 mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱3～5 min，溶液變?yōu)轷r亮的酒紅色，停止加熱，冷卻至室溫全波長(zhǎng)掃描鑒定金顆粒大小及均一度。定容到100 mL，置4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 金標(biāo)抗體的制備

1．5．1 膠體金顆粒與抗體結(jié)合最適p H范圍

用0．l mol／L的 K2CO3溶液和0．5 moL／L的HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液的p H 分別為5．0、5．5、6．0、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0、9．5；分別加入20μg的標(biāo)記抗體混勻制成金標(biāo)抗體穩(wěn)定30 min后分別加入0．l mL 10%的NaCl，1500 g離心，測(cè)上清在520 nm處的光密度。

1．5．2 膠體金顆粒最適加入抗體標(biāo)記量

0．1 mol／L K2CO3或0．1 mol／L HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液p H至標(biāo)記最適結(jié)合p H。將調(diào)好p H的膠體金溶液分裝10管，每管1 mL。加入標(biāo)記抗體使每管濃度依次為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg／mL。對(duì)照管加1 mL稀釋液（不含抗體蛋白），混勻。靜置穩(wěn)定30 min后，在上述各管中加入0．1 mL 10%的Na Cl溶液，混勻后靜置2 h，測(cè)上清在520 n m處的光密度。

1．5．3 金標(biāo)抗體的制備及純化

用0．1 mol／L K2CO3調(diào)節(jié)30 mL膠體金溶液至最適合p H 10．0～10．5，磁力攪拌器勻速攪拌，緩慢滴加標(biāo)記抗體Xcc－2D8，繼續(xù)攪拌40 min；加入10%BSA溶液，使終濃度為1%，靜置1 h；加入1%PEG20000，使終濃度為0．1%，靜置40 min；金標(biāo)抗體4℃15 000 r／min離心30 min；收集管靜置底可流動(dòng)的暗紅色沉淀于保存液［30］中，4℃保存。

1．6 速測(cè)卡的組裝及結(jié)果判定

依次將硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、吸水墊、樣品墊粘貼在底板上，裁剪成0．4 c m×5．5 c m的速測(cè)卡，包被塑料卡套，放入鋁箔袋中，加入干燥劑，密封4℃保存。

檢測(cè)滴加待測(cè)樣液60～80μL到加樣區(qū)，5 min后觀察結(jié)果。若僅出現(xiàn)質(zhì)控C線未見檢測(cè)T線則說明樣品為陰性；若同時(shí)出現(xiàn)質(zhì)控C線和檢測(cè)T線則說明樣品為陽性；若無條帶或僅出現(xiàn)檢測(cè)T線未見質(zhì)控C線則說明檢測(cè)結(jié)果無效。顯色過程應(yīng)該在5～10 min中內(nèi)完成，超過規(guī)定時(shí)間所得結(jié)果不具有參考價(jià)值。

1．7 速測(cè)卡性能分析及評(píng)價(jià)

1．7．1 速測(cè)卡特異性分析

采用抗原菌Xcc以及其他植物病原菌、柑橘伴生菌及常見細(xì)菌共10株供試菌種，分別稀釋成高濃度菌懸液（A600＝0．5，約1×108cf u／mL），滴管吸取60～80μL分別滴加到加樣區(qū)，5 min后觀察并記錄結(jié)果，驗(yàn)證膠體金速測(cè)卡的特異性效果。該試驗(yàn)重復(fù)3次保證結(jié)果的真實(shí)可靠。

1．7．2 速測(cè)卡靈敏度分析

將抗原菌Xcc稀釋成10倍梯度，即1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101cf u／mL的菌懸液。滴管吸取60～80μL分別滴加到加樣區(qū)，5 min后觀察并記錄結(jié)果，測(cè)試膠體金速測(cè)卡的菌懸液最低檢測(cè)下限。該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1．7．3 速測(cè)卡穩(wěn)定性分析

將同批制作的膠體金速測(cè)卡分若干份，密封干燥儲(chǔ)存在4℃冰箱中。于7、15、30、60、90、180 d時(shí)取出，檢測(cè)抗原菌Xcc菌懸液 （A600＝0．5，約1×108cf u／mL），驗(yàn)證膠體金速測(cè)卡的保存穩(wěn)定性。該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1．7．4 速測(cè)卡批間重復(fù)性檢測(cè)

隨機(jī)抽取5個(gè)批次的膠體金速測(cè)卡，分別測(cè)試Xcc菌懸液（陽性對(duì)照）、樣品稀釋液（陰性對(duì)照）、顯癥葉片浸出液，每個(gè)樣本重復(fù)3次，判斷速測(cè)卡是否存在批次間差異。

1．7．5 與q PCR法結(jié)果一致性分析

q PCR與速測(cè)卡檢測(cè)模板均為柑橘樣品無菌水浸泡液。本實(shí)驗(yàn)室前期建立qPCR方法檢測(cè)來自重慶忠縣、巫山、渝北、江津等地區(qū)的206份柑橘送檢樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。對(duì)該206份送檢樣品的浸泡液分別滴加60～80μL到加樣區(qū)，5 min后觀察并記錄結(jié)果，每個(gè)樣本重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)兩種方法所得結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 抗體特性評(píng)價(jià)及篩選

2．1．1 抗體特異性測(cè)試

采用ELISA方法驗(yàn)證單克隆抗體、多克隆抗體及重組抗體的特異性，以植物病原細(xì)菌、柑橘組織內(nèi)生菌、常見細(xì)菌作對(duì)照。結(jié)果顯示單克隆抗體（Xcc－2D6和Xcc－2D8）與抗原菌Xcc有很好的結(jié)合活性，對(duì)其余10種對(duì)照細(xì)菌無結(jié)合能力，特異性最好。多克隆抗體（Xcc－Pab2）、重組抗體（Xcc－sc－dsf v）與抗原菌Xcc有很好的結(jié)合活性，對(duì)其余10種對(duì)照細(xì)菌無明顯結(jié)合能力，特異性較好。

圖1 各抗體特異性測(cè)試結(jié)果

2．1．2 抗體靈敏度測(cè)試

抗體的靈敏度直接影響膠體金速測(cè)卡的測(cè)試性能，為驗(yàn)證抗體靈敏度，將單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體從1∶103倍開始等比例稀釋到1∶106倍，用ELISA方法驗(yàn)證各稀釋度的抗體與抗原菌抗原菌Xcc的結(jié)合能力。結(jié)果顯示各種抗體在稀釋1∶16 000～1∶32 000范圍內(nèi)結(jié)合能力下降最快。單克隆抗體Xcc－2D6對(duì)抗原菌Xcc的結(jié)合能力達(dá)到1∶256 000倍；單克隆抗體Xcc－2D8對(duì)抗原菌Xcc的結(jié)合能力達(dá)到1∶128 000倍；多克隆抗體Xcc－Pab2對(duì)抗原菌Xcc的結(jié)合能力達(dá)到1∶128 000倍；重組抗體Xcc－sc－dsf v對(duì)抗原菌Xcc的結(jié)合能力達(dá)到1∶64 000倍。

圖2 各抗體靈敏度

2．1．3 抗體穩(wěn)定性測(cè)試

抗體的穩(wěn)定性是衡量膠體金速測(cè)卡成功與否的另一重要標(biāo)準(zhǔn)，間接ELISA方法分別測(cè)試30、60、90、120、150、180 d時(shí)單抗、多抗、重組抗體在低溫下長(zhǎng)時(shí)間放置后與抗原菌Xcc結(jié)合能力的變化。結(jié)果顯示抗體在低溫下放置結(jié)合能力沒有出現(xiàn)陡然下降的現(xiàn)象；穩(wěn)定性從大到小依次為單克隆抗體Xcc－2D8＞單克隆抗體Xcc－2D6＞多克隆抗體Xcc－pab2＞重組抗體Xcc－sc－dsf v；放置180d后單克隆抗體Xcc－2D8的活性仍保持50%，單克隆抗體Xcc－2D6活性保持40%，多克隆抗體Xcc－pab2和重組抗體Xcc－sc－dsf v的活性僅存20%以下。

圖3 各抗體穩(wěn)定性

根據(jù)3項(xiàng)性能評(píng)價(jià)，雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體Xcc－2D8和Xcc－2D6性能相對(duì)較優(yōu)，為后續(xù)膠體金速測(cè)卡的研究提供一定參考。

2．2 膠體金顆粒的制備

制備好的膠體金顆粒呈鮮紅透亮狀態(tài)，在室溫下放置能穩(wěn)定保持該狀態(tài)。用全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)掃描測(cè)得它的最大吸收波長(zhǎng)Amax＝520．324 n m，在該處的光密度為A520＝0．597 8。

2．3 金標(biāo)抗體的制備及純化

2．3．1 膠體金顆粒與抗體結(jié)合最適p H范圍

p H值直接影響金標(biāo)抗體的結(jié)合穩(wěn)定性。根據(jù)測(cè)試各p H梯度下金標(biāo)抗體結(jié)合物的吸光值，結(jié)果顯示標(biāo)記p H值與抗體相關(guān)，不同抗體的最適p H值不同，多克隆抗體Xcc－pab2的最適標(biāo)記p H為8．0～8．5范圍內(nèi)，單克隆抗體 Xcc－2D8和Xcc－2D6的最適標(biāo)記p H為10．0～10．5范圍內(nèi)，在此范圍p H值下金標(biāo)抗體的光密度最大，說明抗體與膠體金顆粒的吸附最為穩(wěn)定。

圖4 不同p H下各抗體標(biāo)記膠體金溶液的最大吸光度值

2．3．2 金標(biāo)抗體最適標(biāo)記量

抗體標(biāo)記量是直接影響金標(biāo)抗體的結(jié)合穩(wěn)定性的另一關(guān)鍵因素。測(cè)試各抗體濃度梯度下金標(biāo)抗體結(jié)合物的吸光值，結(jié)果顯示20 mg／mL以上抗體加入量能保證與膠體金顆粒穩(wěn)定吸附，并抵抗高鹽離子的加入。

圖5 標(biāo)記不同量抗體后膠體金溶液的最大吸光度值

2．4 速測(cè)卡性能評(píng)價(jià)

2．4．1 速測(cè)卡特異性測(cè)試

對(duì)照菌選取了植物病原菌水稻白葉枯病菌（Xanthomonas or yzae pv．or yzae）、番 茄 潰 瘍 病 菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）、甘藍(lán)黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv．campestris）及番茄青枯病菌（Ralstonia solanacear um），4種從柑橘組織分離的伴生菌（鑒定為黃單胞菌屬Xanthomonas）以及常見細(xì)菌蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽胞桿菌（B．subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）

速測(cè)卡測(cè)試結(jié)果顯示：測(cè)試Xcc速測(cè)卡為陽性，其余11種菌種的速測(cè)卡陰性，質(zhì)控線（C線）顯色證明結(jié)果可靠。特異性檢測(cè)時(shí)供試菌懸液濃度偏高（A600＝0．5），8、9號(hào)速測(cè)卡檢測(cè)伴生黃單胞菌時(shí)檢測(cè)線（T線）隱約顯色，但對(duì)照12號(hào)Xcc速測(cè)卡檢測(cè)線顏色明顯偏淡，該現(xiàn)象為細(xì)菌濃度過高出現(xiàn)的輕微堆積現(xiàn)象，而不是抗原抗體特異性反應(yīng)的正常顯色。

圖6 速測(cè)卡測(cè)試Xcc以及其他11種常見菌種

2．4．2 速測(cè)卡靈敏度檢測(cè)

將Xcc菌懸液從1×108cfu／mL稀釋到1×101cfu／mL，用速測(cè)卡測(cè)試。根據(jù)結(jié)果，免疫金層析速測(cè)卡能夠檢測(cè)1×103～1×104濃度的Xcc菌懸液。

圖7 速測(cè)卡靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2．4．3 速測(cè)卡批間重復(fù)性檢測(cè)

隨機(jī)5個(gè)批次速測(cè)卡測(cè)試Xcc菌懸液 （陽性對(duì)照）、樣品稀釋液（陰性對(duì)照）、病葉浸出液，每個(gè)樣本重復(fù)3次，觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。隨機(jī)5個(gè)批次速測(cè)卡對(duì)Xcc菌懸液（陽性對(duì)照）、樣品稀釋液（陰性對(duì)照）、顯癥葉片浸出液檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)：5個(gè)批次速測(cè)卡測(cè)試結(jié)果一致，無批間差異。

2．4．4 速測(cè)卡與q PCR方法檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)206份柑橘樣品的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：206份樣品中q PCR法檢出陽性樣本為66個(gè)，陰性樣本140個(gè)；膠體金速測(cè)卡法檢出陽性樣本為56個(gè)，陰性樣本150個(gè)。兩組方法測(cè)試結(jié)果差異存在于10份無病癥攜帶微量柑橘潰瘍病Xcc樣本，此種樣本q PCR法檢出為陽性，膠體金速測(cè)卡法檢出為陰性。對(duì)所有qPCR法檢出為陰性的樣本，膠體金速測(cè)卡法檢出亦為陰性，與q PCR法結(jié)果無差異。

經(jīng)計(jì)算兩種檢測(cè)方法結(jié)果如下。

符合率kap pa值＝（56＋140）／（56＋0＋10＋140）×100%＝95．15%；

速測(cè)卡陽性檢出率＝56／（56＋10）＝84．85%；

速測(cè)卡陰性檢出率＝140／（140＋0）＝100%。

表2 速測(cè)卡與qPCR實(shí)測(cè)柑橘送檢樣品匯總表

3 討論

3．1 膠體金顆粒的制備

在制備前必須對(duì)所有玻璃儀器進(jìn)行清潔處理，并酸化硅化。因?yàn)榻痤w粒外層所帶的等量負(fù)電荷保證膠體的穩(wěn)定，也是它們能與抗體蛋白穩(wěn)定吸附的重要因素。任何微量的電解質(zhì)都可能破壞膠體金溶液的帶電環(huán)境，影響金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性，所以要特別注意避免微量污染，在每次使用前都要對(duì)玻璃儀器進(jìn)行徹底的清洗，并用三蒸水沖洗數(shù)次。

本試驗(yàn)采用的膠體金大小為30n m左右。不同大小的金顆粒應(yīng)用到膠體金速測(cè)卡上產(chǎn)生的效果截然不同，根據(jù)免疫層析的原理，檢測(cè)線及質(zhì)控線的顯色是由于金顆粒的堆積形成的。金顆粒粒徑過大容易在檢測(cè)線處堆積；然而粒徑過小，大量的金不容易封閉完全，剩下的位點(diǎn)會(huì)吸附其他待測(cè)樣品，也容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，膠體金顆粒的大小直接影響顯色效果，因此在試驗(yàn)中要對(duì)所制備膠體金顆粒的大小進(jìn)行鑒定。均勻度不好的膠體金顆粒會(huì)出現(xiàn)聚集成黑色大顆粒沉淀的現(xiàn)象，在制備金標(biāo)抗體時(shí)離心的過程中出現(xiàn)掛壁的現(xiàn)象。

3．2 金標(biāo)抗體最適p H

新制備的膠體金溶液的p H在5．5左右，放置一段時(shí)間其p H不會(huì)發(fā)生變化。當(dāng)標(biāo)記抗體蛋白后，由于抗體蛋白的帶電作用，要調(diào)整溶液的p H值，使金顆粒與抗體蛋白穩(wěn)定的結(jié)合。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)最適p H應(yīng)該是一個(gè)p H范圍而非準(zhǔn)確值，每株抗體的最適標(biāo)記p H范圍均不同，多克隆抗體Xccpab2的最適標(biāo)記p H為8．0～8．5范圍內(nèi)，單克隆抗體Xcc－2D8和 Xcc－2D6的最適標(biāo)記p H 為10．0～10．5范圍內(nèi)，因此每使用一株抗體都要進(jìn)行最適p H的分析。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是：在非最適p H時(shí)抗體蛋白會(huì)與膠體金顆粒聚集沉淀，但當(dāng)抗體失去生物活性后金顆粒又會(huì)重新懸浮起來，恢復(fù)鮮紅透亮的穩(wěn)定膠體狀態(tài)，其p H也回到了最初的范圍（5．5左右）。

3．3 測(cè)試卡性能評(píng)價(jià)

前期同類產(chǎn)品［25］檢測(cè)下限在1×106cf u／mL。本研究制備的膠體金免疫層析速測(cè)卡用于檢測(cè)柑橘潰瘍病菌靈敏度高，檢測(cè)下限為1×103～1×104cfu／mL，較之前靈敏度得到了很大的提高。采用畫線而非點(diǎn)滴的方式固定檢測(cè)線和指控線，速測(cè)卡背景降低，外觀上有了較大的改進(jìn)。

由于柑橘潰瘍病是植物細(xì)菌性病害，因此選擇了其他植物致病菌、從柑橘組織中分離的伴生菌以及環(huán)境中常見的細(xì)菌來檢測(cè)特異性，速測(cè)卡無交叉反應(yīng)，特異性的效果理想。

與目前最靈敏穩(wěn)定的q PCR方法比較，結(jié)果一致性達(dá)到了95．15%。主要差異存在于10份無病癥攜帶微量柑橘潰瘍病Xcc樣本，此種樣本q PCR法檢出為陽性，膠體金速測(cè)卡法檢出為陰性。q PCR方法的檢測(cè)靈敏度在1×101～1×102cf u／mL，微量的細(xì)菌靶DNA能夠在q PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增并放大信息。而膠體金速測(cè)卡的顯色原理是由抗體結(jié)合待測(cè)樣品中的細(xì)菌，并在檢測(cè)線抗體的攔截堆積下形成顯色條帶，待測(cè)樣品中的細(xì)菌不能自行擴(kuò)增，所以細(xì)菌的量是造成最后顯色深淺的直接因素。細(xì)菌濃度過低，截留效果不明顯，檢測(cè)線所顯色的結(jié)果就會(huì)顯得模棱兩可，需要進(jìn)一步采用其他方法進(jìn)行判別。但是目前的檢測(cè)下限在實(shí)際應(yīng)用中已經(jīng)可以對(duì)大部分樣品進(jìn)行初步診斷，對(duì)于少數(shù)結(jié)果不太有把握的樣本送檢相關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)，工作量已經(jīng)大幅度的減少，為基礎(chǔ)檢驗(yàn)檢疫工作提供了一定的幫助。

4 結(jié)論

本研究利用免疫學(xué)技術(shù)所研發(fā)柑橘潰瘍病菌膠體金速測(cè)卡靈敏度下限1×103～1×104cfu／mL，快速，特異性強(qiáng)，效果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，與常規(guī)qPCR方法的檢測(cè)結(jié)果一致性高（kappa值＝95．15%），具有一定的實(shí)用效果，基本滿足柑橘實(shí)際樣品的柑橘潰瘍病的快速診斷檢測(cè)要求，達(dá)到向基層推廣使用，克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷的研究目的。

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