16s r DNA文庫法分析番石榴果實蠅共生菌組成

戴 陽， 李志紅＊， 柳麗君， 吳佳教， 鄧裕亮

（1．中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，北京 100193； 2．廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣州 510623；3．西雙版納出入境檢驗檢疫局，景洪 666100）

番石榴果實蠅［Bactrocer a correcta （Bezzi）］隸屬于雙翅目（Diptera），實蠅科（Tephritidae），寡鬃實蠅亞科（Dacinae），寡鬃實蠅族（Dacini），果實蠅屬（Bactr ocer a），是為害水果的一類重要經(jīng)濟實蠅。番石榴果實蠅主要分布在亞洲的印度、巴基斯坦、泰國、尼泊爾、斯里蘭卡、緬甸、越南［1］，目前，該蟲在我國主要分布在臺灣和云南的局部地區(qū)［2－3］。2007年5月28日，農(nóng)業(yè)部與國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局公布《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，將果實蠅屬列為檢疫性有害生物，而番石榴果實蠅是果實蠅屬中的重要種類。

共生菌是存在于昆蟲體內(nèi)特定部位的微生物，可分為初級共生菌和次級共生菌。初級共生菌在宿主體內(nèi)垂直傳遞并與宿主協(xié)同進化，次級共生菌同時存在垂直傳遞和水平傳遞［4］。共生菌通過生物合成為宿主提供必需的氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，幫助宿主降解有害物質(zhì)［5－6］，在進化中趨向同寄主建立共生關(guān)系，許多共生菌還存在與宿主協(xié)同進化的現(xiàn)象［7－8］。隨著動物胃腸道微生態(tài)理論的發(fā)展，細菌和昆蟲宿主間廣泛存在的互利互惠關(guān)系不斷被發(fā)現(xiàn)［9］。近年來，國外研究者針對油橄欖實蠅［Bactrocer a oleae（Gmelin）］、地中海實蠅［Cer atitis capitata （Wiedemann）］等多種實蠅的共生菌展開研究。Kounatidis用16s r DNA文庫構(gòu)建技術(shù)，通過油橄欖實蠅DNA提取、通用引物的PCR擴增及產(chǎn)物純化、克隆轉(zhuǎn)化、測序及比對，發(fā)現(xiàn)油橄欖實蠅的優(yōu)勢共生菌為醋酸桿菌［10］，Daniela等通過解剖觀察，發(fā)現(xiàn)地中海實蠅的主要共生菌為聚團腸桿菌［11］，Capuzzo等人利用16s r RNA基因序列研究了油橄欖實蠅的共生菌，發(fā)現(xiàn)一種與宿主協(xié)同進化的共生菌并將其命名為“Cantidatus Er winia Dacicola”［12］。

本研究采用16s r DNA文庫構(gòu)建技術(shù)及克隆測序方法，檢測了番石榴果實蠅室內(nèi)種群共生菌的多樣性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1．1 試驗材料及主要生化試劑

1.1.1 試驗材料

本研究所用的番石榴果實蠅樣品由廣東檢驗檢疫技術(shù)中心提供，為室內(nèi)飼養(yǎng)。取雌蟲、雄蟲各1頭用于共生菌16s DNA文庫的構(gòu)建。樣品浸存于無水乙醇中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．1．2 主要試劑

血液／細胞／組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、10×Taq Buffer（含15 mmol／L Mg Cl2）、2．5 mmol／L d NTPs、2．5 U／μL Taq DNA 聚合酶、D2000 DNA分子量標準、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技公司，p MD19－T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。

1．2 16s r DNA文庫的建立

1．2．1 單頭實蠅基因組DNA提取

用無菌水將實蠅樣品快速洗凈后，采用 “血液／細胞／組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）”提取單頭實蠅成蟲樣品的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量。

1．2．2 番石榴果實蠅共生菌16s r DNA序列擴增

參考Willam等的研究［13］，引物采用真細菌16S r DNA正向通用引物27 F；反向通用引物1492R．，該對通用引物可以從廣泛的真細菌中擴增出16S r DNA片段。50μL PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液5．0μL（含15 mmol／L Mg Cl2），正反向引物（10μmol／L）各1．0μL，d NTPs（各2．5 mmol／L）4．0μL，DNA模板2．5μL，Taq酶1．2 U，加無菌水至50μL；熱循環(huán)程序為95℃5 min，接著進行35個循環(huán)（94℃3 min，55℃30 s，72℃1 min），最后在72℃反應(yīng)10 min后結(jié)束。PCR擴增產(chǎn)物為各種真細菌16s r DNA片段的混合物。

表1 PCR引物信息

1．2．3 擴增產(chǎn)物純化及克隆

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外凝膠成像儀下將目的條帶切下，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、純化。純化產(chǎn)物與p MD19－T載體于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆。

1．2．4 菌落PCR驗證

采用菌落PCR驗證白色菌落是否為插入了目的片段的陽性克隆。25μL PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液2．5μL（含15 mmol／L MgCl2），正反向引物（10μmol／L）各 0．2μL，d NTP（各2．5 mmol／L）2．0μL，Taq酶0．6U，加無菌水至25μL，挑取單個菌落作為DNA模板加入；熱循環(huán)程序為：95℃5 min，接著進行38個循環(huán)（94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min），最后在72℃反應(yīng)10 min后結(jié)束。PCR產(chǎn)物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色10 min，紫外成像系統(tǒng)檢測。

1．2．5 限制性內(nèi)切酶分析及測序

限制性內(nèi)切酶為MspⅠ，反應(yīng)體系為10μL，包括10×緩沖液1μL，PCR產(chǎn)物9μL，內(nèi)切酶4 U，加去離子水至10μL，37℃溫浴過夜。酶切產(chǎn)物采用2%瓊脂糖冰浴電泳分離。

對酶切圖譜進行鑒定、比較，將酶切圖譜一致的歸為同一個分類操作單元OTU（operational taxonomic unit），挑取同一OTU的代表性克隆子送北京奧科公司進行雙向測序。將不同反應(yīng)所獲得的序列進行拼接，獲得16s r DNA片段序列（約1．5 kb）。將拼接序列進行BLAST比對（http：∥www．ncbi．nl m．nih．gov／BLAST）。

2 結(jié)果及分析

2．1 番石榴果實蠅共生菌總DNA的PCR擴增

樣品總DNA的PCR擴增見圖1，通過PCR擴增獲得的條帶約為1．5 kb，且無非特異性條帶。得到的擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后用于16s r DNA文庫的建立。

圖1 番石榴果實蠅共生菌的16s r DNA擴增圖譜

2．2 番石榴果實蠅雄蟲共生菌及其分析

將酶切圖譜進行比較、分組，共獲得11個OTU，如圖2a所示，每一個類型選取一個代表性序列進行克隆測序并參考Kounatidis等人的方法統(tǒng)計豐度［10］，共 獲 得 11 條 16s r DNA 序 列，長 度 為1．5 kb左右。通過BLAST N搜索Gen Bank數(shù)據(jù)庫，選擇數(shù)據(jù)庫中相似性最高且至少大于95%的序列（表2）。相似度分別從95%到99%。從表2可以看出，番石榴果實蠅雄蟲共生菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬 （Acinetobacter）、寡 養(yǎng) 單 胞 菌 屬 （Stenotr ophomonas）、脂環(huán)酸芽胞桿菌屬（Alicyclobacill us）、黃桿菌 科 （Flavobacteriaceae）、乳 球 菌屬 （Lactococcus）、噬酸菌屬（Acidovor ax）、Orbus菌屬以及檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）。其中假單胞菌有2種，其他共生菌各1種。在這10個屬（科）中，乳球菌屬和假單胞菌屬占了50%左右，其中乳球菌約為23．6%，假單胞菌約為26．4%。

2．3 番石榴果實蠅雌蟲共生菌及其分析

將番石榴果實蠅雌蟲共生菌文庫中的13個OTU選取代表性序列進行測序，去掉空載體及無效序列，共得13條16s r DNA序列。通過BLAST N搜索GenBank數(shù)據(jù)庫，選擇數(shù)據(jù)庫中相似性最高的序列（表3），相似度從91%到99%。從表3可以看出，番石榴實蠅雌蟲共生菌屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactr um）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、脫硫弧菌屬（Desul f ovibrio）、醋桿菌屬（Acetobacter）。其中腸桿菌屬有5種，醋桿菌屬有3種，其他屬的細菌各1種。腸桿菌屬是優(yōu)勢共生菌，約占33．9%。

圖2 共生菌文庫中部分克隆子RFLP結(jié)果

表2 番石榴果實蠅（雄）廣州種群共生菌組成和相對豐度1）

表3 番石榴果實蠅（雌）廣州種群共生菌組成和相對豐度

3 討論

本研究在番石榴果實蠅雄蟲中鑒定了11種細菌，隸屬于假單胞菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、脂環(huán)酸芽胞桿菌屬、黃桿菌科、乳球菌屬、噬酸菌屬、Orbus菌屬以及檸檬酸桿菌屬，表明了番石榴果實蠅中存在多種共生菌。番石榴果實蠅雄蟲體內(nèi)豐度較高的假單胞菌在地中海實蠅和油橄欖實蠅中也曾被發(fā)現(xiàn)過［10，14］，但并非優(yōu)勢菌。而另外一種豐度較高的乳球菌則未有文獻報道。另外，墨西哥實蠅中也曾發(fā)現(xiàn)過檸檬酸桿菌［15－16］。

本研究在番石榴果實蠅雌蟲中檢測到了13種細菌，隸屬于假單胞菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、叢毛單胞菌屬、蒼白桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、脫硫弧菌屬、醋桿菌屬。其中腸桿菌屬和醋酸桿菌為優(yōu)勢共生菌。

研究表明初級共生菌與次級共生菌相比GC含量較低，這有利于基因的快速進化［17］，如尖音庫蚊（Culex pipiens）感染的Wol bachia，其16s r DNA序列的GC含量為46．6%［18］，阮永明檢測的B型煙粉虱初級共生菌16s r DNA序列，GC含量為48．2%，次級共生菌為54．1%［19］；李正西研究桃蚜初生共生菌，發(fā)現(xiàn)其16s r DNA序列GC含量為49．5%，而次生共生菌為55．5%［20］。本研究鑒定的細菌序列中，GC含量最低為51．0%，多數(shù)接近自由生活的細菌。據(jù)此可以推測本研究鑒定的細菌均為次級共生菌。

腸桿菌科在實蠅共生菌中具有重要地位，Daniela在地中海實蠅中發(fā)現(xiàn)了克雷伯氏菌和腸桿菌［11］，繞實蠅屬、按實蠅屬和果實蠅屬中都有腸桿菌存在［12，16，21］。

次級共生菌部分來自于垂直傳遞，部分來自于不同寄主的水平傳遞。受環(huán)境影響，昆蟲的次級共生菌不如初級共生菌穩(wěn)定，容易發(fā)生改變。如腸桿菌科細菌多存在昆蟲腸道中，隨取食而攝取，隨糞便而排出［20］。但這并不能排除與宿主協(xié)同進化的共生菌的存在。

本研究在雄蟲中發(fā)現(xiàn)豐度較高的綠膿假單胞菌和豐度較低的腸桿菌屬細菌，而在雌蟲中這一結(jié)果正好相反。Behar等在地中海實蠅中同樣也分離出綠膿假單胞菌P．a(chǎn)er uginosa。該菌具有致病性，能降低宿主昆蟲的壽命［14］。腸桿菌科細菌具有拮抗致病菌、降解有毒物質(zhì)、增加宿主適應(yīng)性的功能，另外，腸桿菌還能夠促進宿主的碳氮代謝循環(huán)［22］。假單胞菌和腸桿菌互為消長，這與兩類細菌的生理學功能相吻合。食物對昆蟲腸道的微生物影響比較復(fù)雜，不同的食物可能會影響共生菌的組成［23］。有人認為在野生狀態(tài)下，昆蟲攝取的果實中含有的次生代謝物質(zhì)會具有一定的殺菌作用，可能會影響腸道共生菌，尤其傾向選擇某些有解毒功能的細菌［24］。蟑螂在取食低蛋白、高纖維食物時，前腸的鏈球菌（Streptococci）和乳桿菌（Lactobacilli）數(shù)量減少，高蛋白的食物則導致H2和CO2產(chǎn)量減少以及G＋C細菌增多［25］。因此筆者估計飼養(yǎng)種群與野外種群的共生菌多樣性可能存在差異。

目前針對昆蟲共生菌的分離鑒定研究方法主要有3種，即傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定法、顯微觀察法和以變性梯度凝膠電泳（PCR－DGGE）和16s r DNA文庫構(gòu)建為主的分子生物學方法。相比傳統(tǒng)的微生物學方法，分子生物學方法能全面獲得共生菌的信息，而且不受細菌是否可培養(yǎng)的限制。本研究采用的16s r DNA文庫構(gòu)建和測序方法，不僅獲得序列信息比PCR－DGGE更為豐富，還能評估各細菌的豐度，且不需要昂貴的儀器設(shè)備［26］。

研究結(jié)果為探索番石榴果實蠅共生菌的生理功能及其與宿主的協(xié)同進化關(guān)系提供了基礎(chǔ)。在明確共生菌多樣性的基礎(chǔ)上，結(jié)合相關(guān)文獻報道，選取對番石榴果實蠅入侵起正作用的共生菌開展研究。針對可培養(yǎng)細菌，通過高溫或抗生素去除共生菌，然后通過飼喂或顯微注射導入，通過生物學試驗明確共生菌對寄主的生理功能，可以明確共生菌對番石榴果實蠅的生物學功能，并進一步揭示番石榴果實蠅和共生菌協(xié)同、快速入侵的機制。

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