早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)帕金森小鼠中腦和紋狀體的影響：自噬與線粒體動(dòng)力學(xué)關(guān)系的研究

姜寧曹瑋宋超郭晶晶劉洪濤 張勇,

1軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所（天津300050）2天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

帕金森癥（Parkinson’s disease，PD），又稱震顫麻痹，是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)病變。隨著我國(guó)人口老齡化，該病的患病率呈增加態(tài)勢(shì)。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)PD進(jìn)行了大量研究，但PD的發(fā)病機(jī)制尚未明確。自噬（Autophagy）是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在溶酶體中批量降解并涉及亞細(xì)胞膜重構(gòu)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。自噬在改善損傷的細(xì)胞功能方面的作用已引起廣泛關(guān)注［1］。研究表明［2］，自噬在清除與神經(jīng)性疾病相關(guān)的細(xì)胞器，尤其是在PD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，早期規(guī)律從事體育運(yùn)動(dòng)或體力勞動(dòng)的人口，PD發(fā)病率顯著降低［3］。本課題組前期研究也表明，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可以提高PD小鼠腦線粒體功能，延緩或減少中腦多巴胺神經(jīng)元的死亡，增加中腦黑質(zhì)細(xì)胞數(shù)量［4］。但其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠PD模型，觀察早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)PD小鼠中腦和紋狀體線粒體呼吸功能、ATP酶合成活力和自噬相關(guān)蛋白的變化，探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)防治帕金森等神經(jīng)退化性疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

雄性C57BL/6小鼠（22～24g），6～8周齡。日光照時(shí)間12小時(shí)，室溫20℃。隨機(jī)分為4組：安靜+生理鹽水組（N組）、運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組（NE組）、安靜+ MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶）組（M組）和早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+MPTP組（ME組），每組15只。

1.2 訓(xùn)練方案和帕金森病模型制作

運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行2天適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練 （5 m/ min，10 min），以后每天上午進(jìn)行1次中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練（12 m/min，20 min，6天/周），連續(xù)6周。訓(xùn)練結(jié)束后，安靜+MPTP組和早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+MPTP組接受中等劑量MPTP注射（30 mg/kg×2次，ip，間隔16小時(shí)），其余兩組小鼠在相同時(shí)間、以相同方式接受同等劑量的生理鹽水注射。每次小鼠腹腔內(nèi)注射MPTP 10 min后，出現(xiàn)靜止性振顫、運(yùn)動(dòng)減少、后肢僵硬豎尾、立毛等行為學(xué)表現(xiàn)，約持續(xù)30 min后振顫消失，但運(yùn)動(dòng)減少仍然存在。接受生理鹽水注射的動(dòng)物無(wú)上述表現(xiàn)。于造模后第7天取材。

1.3 腦組織線粒體提取

實(shí)驗(yàn)小鼠取材前一天禁食大于12小時(shí)后，脫臼處死，按小鼠腦立體定位圖取中腦和紋狀體。按照5 ml/g組織的用量加入分離介質(zhì)，在預(yù)冷的玻璃勻漿器中上下均勻勻漿10次，勻漿液離心（1200g、4℃、10 min）。將上清4℃暫放，取沉淀，加入分離介質(zhì)，重復(fù)勻漿離心，取上清，與前次勻漿后上清合并離心（12000g、4℃、10 min），棄上清，沉淀即為粗制線粒體。每克組織加入保存介質(zhì)約80 μl，取樣測(cè)定蛋白濃度。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，用280 nm下校正的BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線，室溫下測(cè)定。

1.4 線粒體呼吸功能檢測(cè)

線粒體呼吸功能采用 Clark氧電極法，用Oxytherm測(cè)氧儀（Hansatech-Instruments Co.，UK）測(cè)定態(tài)3呼吸速率（state 3）、態(tài)4呼吸速率（state 4）及呼吸控制比（respiratory control ratio，RCR）。反應(yīng)體系 1 ml，30℃恒溫。反應(yīng)介質(zhì)為：130 mM KCl，10 mM Hepes，1 mM EDTA，2.5 mM KH2PO4，1.5 mg defatted BSA，pH 7.4。線粒體蛋白濃度為1 mg/ml。加入0.1 mmol/L蘋果酸和1 mmol/L谷氨酸啟動(dòng)態(tài)4呼吸。平穩(wěn)后加入200 nmol ADP啟動(dòng)態(tài)3呼吸。ADP耗盡后重又回到態(tài)4呼吸。記錄儀記錄耗氧曲線。由此可算出態(tài)3、態(tài)4呼吸以及RCR（態(tài)3/態(tài)4）。

1.5 線粒體ATP合成酶活力測(cè)定

采用20/20n型發(fā)光儀熒光素－熒光素酶發(fā)光法測(cè)定ATP合成酶活力。反應(yīng)溫度為25℃，在0.5 ml反應(yīng)體系中含有0.5 mM EDTA，10 mM HEPES，5 mM磷酸鹽緩沖液，2.5 mM MgCl2，0.5 M蘋果酸/0.25 M谷氨酸，100 μl熒光素－熒光素酶，50 μg線粒體。記錄以上體系的發(fā)光強(qiáng)度為本底，加入4 μl ADP啟動(dòng)反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度在不加線粒體和ADP的平行實(shí)驗(yàn)中，加入1 nM ATP，記錄發(fā)光強(qiáng)度，標(biāo)定ATP合成量。酶活力單位為nmol/min·mg pro。

1.6 自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3及線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1 mRNA表達(dá)定量測(cè)定

另取中腦和紋狀體組織。Trizol Reagent抽提總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值及OD260/280比值，計(jì)算RNA濃度。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Real-time PCR采用TAKARA的Mix Taq試劑盒于ABI StepOne Real-time PCR儀進(jìn)行。引物序列見表1。所有試劑均以DEPC處理的雙蒸水配制。PCR反應(yīng)體系：SYBR@Premix Ex Taq（2×）10μl，PCR Forward Primer （10μM）0.4μl，PCR Reverse Primer（10μM）0.4μl，ROX Reference Dye （50×）0.4μl，cDNA 2μl，ddH2 O6.8μl。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.7 Western Blot測(cè)定 Beclin 1、LC3-II、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)

RIPA法提取小鼠骨骼肌總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清蛋白濃度。使用Tris-甘氨酸SDS進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕法電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含有5%BSA的抗體稀釋液按比例（分別按1:10000、1:1000、1:5000、1:3000）稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜。然后用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘。用含有5%脫脂奶粉的抗體稀釋液按照1:10000的比例稀釋二抗，室溫孵育1小時(shí)后用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘，加KPL發(fā)光底物，于暗室曝光，膠片經(jīng)顯影、定影后進(jìn)行掃描，以β-tubulin為內(nèi)參經(jīng)Quantity ONE（BIO-RAD）軟件對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行光密度相對(duì)定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（±s），組間比較采用雙因素方差分析（UNIANOVA-General Linear Models），顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 線粒體呼吸功能

如圖1所示，M組小鼠中腦和紋狀體線粒體態(tài)3呼吸顯著低于N組（P<0.01）。ME組態(tài)3呼吸顯著高于M組（P<0.01）。NE組態(tài)3呼吸較N組有所提高，但無(wú)顯著性。各組間態(tài)4呼吸變化無(wú)顯著性。如圖2所示，M組、ME組小鼠中腦線粒體RCR顯著低于N組（P<0.01，P<0.05），ME組顯著高于M組（P<0.01）。NE組和N組相比RCR變化無(wú)顯著性。

圖1 中腦和紋狀體線粒體態(tài)3和態(tài)4呼吸速率

圖2 中腦和紋狀體線粒體呼吸控制比（RCR）

2.2 中腦和紋狀體線粒體ATP酶合成活力

如圖3所示，與N組相比，NE組小鼠中腦和紋狀體線粒體ATP酶合成活力顯著升高（P<0.05）；M組顯著降低 （P<0.01）。ME組較M組顯著升高（P <0.05）。

圖3 中腦和紋狀體線粒體ATP酶合成活力

2.3 中腦和紋狀體組織Beclin 1，LC3基因和蛋白表達(dá)

如圖4所示，與N組相比，NE組、M組、ME組各組Beclin 1 mRNA均顯著升高（P<0.01），分別是N組的2倍、2.54倍和4.47倍；LC3 mRNA顯著升高，分別是N組的1.7倍、1.6倍、2.09倍。與M組相比，ME組Beclin 1 mRNA顯著升高，為M組的1.76倍；LC3 mRNA顯著升高（P<0.01），為M組的1.31倍。如圖5所示，與N組相比，NE組、M組、ME組各組Beclin 1蛋白含量均顯著升高，分別是N組的1.25倍、1.39倍、1.65倍。與N組相比，M組，ME組LC3-II蛋白含量顯著增高，分別為N組的1.45倍、1.77倍。與M組相比，ME組Beclin 1蛋白、LC3-II蛋白均顯著增高（P<0.01）。

圖4 中腦和紋狀體組織Beclin 1、LC3 mRNA表達(dá)

圖5 中腦和紋狀體組織Beclin 1、LC3-II蛋白表達(dá)

2.4 線粒體分裂蛋白Fis1和Drp1的mRNA和蛋白表達(dá)

如圖6所示，與N組相比，NE組、M組、ME組各組Fis1mRNA均顯著升高，分別是N組的2倍、1.91倍、3.41倍；與N組相比，M組和ME組Drp1 mRNA顯著升高，分別是N組的1.62倍、1.95倍。和M組相比，ME組Fis1 mRNA顯著升高（P<0.01）。如圖7所示，與N組相比，NE組、M組、ME組各組Fis1蛋白含量顯著升高，分別是N組的1.43倍、1.29倍和1.53倍；與N組相比，M組、ME組Drp1蛋白含量顯著增高（P<0.01），分別為N組的1.42倍和1.58倍。與M組相比，ME組Fis1蛋白顯著升高（P<0.01）。

圖6 中腦和紋狀體組織Fis1、Drp1 mRNA表達(dá)

圖7 中腦和紋狀體組織Fis1、Drp1蛋白表達(dá)

3 討論

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑，降解內(nèi)容包括長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器。它是一把雙刃劍，適度自噬可有效降解胞質(zhì)大分子和細(xì)胞器，為蛋白質(zhì)合成提供能量，在機(jī)體處于氧化應(yīng)激環(huán)境脅迫時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用，但其過(guò)度活躍或功能低下也會(huì)引發(fā)自噬應(yīng)激，從而對(duì)細(xì)胞造成傷害［5］。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）為真核細(xì)胞中第一種被認(rèn)定的與自噬小泡膜形成有關(guān)的蛋白［6］，LC3-I合成后通過(guò)對(duì)其羧基末端的甘氨酸殘基進(jìn)行剪切修飾，形成LC3-II，LC3-II最終定位于自噬前體和自噬體上，其可用于評(píng)價(jià)自噬水平。Beclin1是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中被確認(rèn)的調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)基因，對(duì)自噬的發(fā)生起到“分子開關(guān)”的作用［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，PD小鼠腦Beclin1、LC3-II表達(dá)均增高，提示MPTP的毒性作用可顯著提高自噬水平。同時(shí)，我們觀察到MPTP的毒性作用造成線粒體功能下降，表現(xiàn)為態(tài)3呼吸、RCR和ATP酶合成活性下降。造模使用的MPTP濃度為30 mg/kg，為中等劑量，雖可造成明顯帕金森癥狀，但其行為學(xué)改變?cè)?周可恢復(fù)正常。因此，該模型造成的腦自噬水平的提高是機(jī)體對(duì)外界損傷的代償反應(yīng)，可發(fā)揮保護(hù)作用。

在單純運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的小鼠腦中，參與調(diào)控自噬的Beclin1水平提高，早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的PD小鼠腦自噬蛋白Beclin1、LC3-II較PD模型組顯著升高。不僅如此，伴隨自噬水平的提高，也觀察到早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的PD模型小鼠腦線粒體功能顯著提高，表現(xiàn)為態(tài)3呼吸提高，ATP生成增多。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，預(yù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與MPTP造模有顯著交互作用，即早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高小鼠中腦和紋狀體線粒體對(duì)MPTP毒性的抵抗，改善線粒體功能。研究提示：早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練初步啟動(dòng)自噬，此時(shí)如果中腦和紋狀體遭遇MPTP的毒性作用，即可及時(shí)調(diào)控自噬過(guò)程，改善線粒體功能。

自噬，起初被認(rèn)為是非選擇性的活動(dòng)。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在應(yīng)對(duì)多種刺激時(shí)可通過(guò)自噬選擇性降解損傷的線粒體，這種現(xiàn)象在酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞普遍存在。當(dāng)酵母細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)，其自噬水平上調(diào)，快速降解線粒體，以節(jié)約能量消耗，在哺乳動(dòng)物中，也同樣可以發(fā)現(xiàn)這一情況［8］。Goldman等［9］認(rèn)為細(xì)胞線粒體發(fā)生損傷時(shí)，線粒體自噬活性增強(qiáng)，從而使得受損線粒體被及時(shí)降解，這也是體內(nèi)清除受損線粒體的主要途徑。

目前，關(guān)于損傷的線粒體如何通過(guò)自噬途徑被清除，及其相關(guān)信號(hào)通路間的相互作用機(jī)制尚無(wú)定論。Twig等［10］針對(duì)線粒體融合分裂在線粒體自噬中的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)線粒體在經(jīng)歷了融合之后會(huì)被分裂成為兩個(gè)子個(gè)體，一部分發(fā)生進(jìn)一步融合，另一部分則不會(huì)。有融合能力的子線粒體會(huì)在融合發(fā)生之前首先恢復(fù)膜電位（ΔΨm），而另一部分子線粒體無(wú)法恢復(fù)ΔΨm，進(jìn)而被自噬清除，即線粒體自噬參與了線粒體質(zhì)量控制過(guò)程。

Parone等［11］研究發(fā)現(xiàn)，敲除了線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1的Hela細(xì)胞，線粒體呼吸功能喪失，ATP濃度下降，細(xì)胞周期縮短，mtDNA部分缺失，而LC3-Ⅱ表達(dá)增加，提示線粒體自噬在敲除Drp1的細(xì)胞中被抑制。Arnoult等［12］同樣發(fā)現(xiàn)，Drp1過(guò)表達(dá)可以驅(qū)動(dòng)線粒體分裂，從而使線粒體消失。而線粒體分裂的另一相關(guān)蛋白Fis1突變也可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)及功能的改變，引起其功能障礙，導(dǎo)致線粒體被清除［13］。這些證據(jù)都提示，線粒體分裂可能是線粒體吞噬前發(fā)生的必要步驟，即線粒體動(dòng)力學(xué)變化與線粒體相關(guān)自噬有著密切聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可上調(diào)中腦和紋狀體組織的線粒體分裂水平。有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量MPTP可促進(jìn)Drp1依賴的線粒體片段化［14］，而線粒體趨向分裂可能有利于加強(qiáng)ATP合成，減少ATP的消耗，滿足細(xì)胞對(duì)能量需求的增加［15］。

目前，對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在延緩PD發(fā)病中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高PD小鼠對(duì)MPTP所致線粒體功能損害的抵抗作用。在這一過(guò)程中，伴隨著自噬水平提高，線粒體分裂水平亦顯著升高，提示線粒體動(dòng)力學(xué)的改變參與了早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)PD小鼠自噬水平增高的調(diào)控過(guò)程。但其相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)

中等劑量的MPTP可損害中腦和紋狀體線粒體功能，使自噬水平代償性增高；早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可初步啟動(dòng)中腦和紋狀體自噬。而當(dāng)MPTP損害發(fā)生時(shí)，這一過(guò)程可及時(shí)調(diào)控線粒體分裂，促進(jìn)自噬水平上調(diào)，進(jìn)而改善中腦和紋狀體線粒體功能，在運(yùn)動(dòng)防治帕金森病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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