電穿孔介導(dǎo)小干擾RNA高效轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎

常博皞，彭輝，田進(jìn)海，蘇建民，張亨德，白學(xué)堯，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

近些年由siRNA (Small interfering RNA) 介導(dǎo)的RNA干擾 (RNAi) 已經(jīng)逐漸成為研究基因功能的有力工具[1-2]。將制備好的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞中的方法主要有顯微注射法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。相比而言，電穿孔法具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。電穿孔的原理是細(xì)胞在脈沖電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時(shí)微孔，導(dǎo)致其通透性和膜電導(dǎo)瞬時(shí)增大，使得在正常生理情況下細(xì)胞膜難以通透的物質(zhì)能夠進(jìn)入細(xì)胞[6-7]。電穿孔法已經(jīng)成功應(yīng)用于向體外培養(yǎng)的細(xì)胞[8-9]、活體組織[10]、附植后胚胎[11]和雄性配子[12]導(dǎo)入蛋白質(zhì)、糖類和DNA等。但是對(duì)由透明帶包裹的附植前胚胎采用電穿孔方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染具有特殊的難度。本研究通過對(duì)透明帶弱化、優(yōu)化電壓、脈沖時(shí)間和脈沖次數(shù)等不同電穿孔參數(shù)，并結(jié)合使用不同介質(zhì)作為電轉(zhuǎn)緩沖液，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和形態(tài)學(xué)觀察比較了各實(shí)驗(yàn)組別轉(zhuǎn)染效果，建立了siRNA轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎的電穿孔方法，為采用由 siRNA介導(dǎo)的 RNAi技術(shù)研究基因在小鼠附植前胚胎中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素 (Pregnant mare serumgonadotrophin，PMSG) 和人絨毛膜促性腺激素 (Human chorionic gonadotropin，hCG) 購自寧波第二激素廠；Cy3標(biāo)記的陰性對(duì)照 siRNA (#AM4621) 和 siPORT (#AM4502) 購自美國Ambion公司；臺(tái)氏液 (#T1788) 購自美國Sigma公司。電穿孔儀器 (ECM 2001 Electro Cell Manipulator) 購自美國BTX公司；電轉(zhuǎn)槽為電穿孔儀器所配套提供，電極間距為1 mm；opti-MEM購自美國Invitrogen公司；其他試劑如未經(jīng)特殊說明均購自美國Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與胚胎采集

健康成年雄鼠及5~7周齡，體重20~25 g昆明小白鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人工控制飼養(yǎng)溫度20 ℃~24 ℃，相對(duì)濕度50%~60%，人工照明12 h光照，12 h黑暗。取雌性小鼠，腹腔注射PMSG 10 IU/只，46 h后注射hCG 10 IU/只，與公鼠1∶1合籠過夜。16 h后檢查陰道栓，查見陰道栓的雌鼠為受精鼠。對(duì)受精鼠逐一頸椎脫臼法處死后，無菌條件下取出雙側(cè)輸卵管，戳破膨大壺腹部，游離出由顆粒細(xì)胞包裹的受精卵細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞團(tuán)置于盛有 PBS (Phosphate buffered saline) 的35 mm皿中清洗1次，隨后將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至 0.2%透明質(zhì)酸酶中消化，顯微鏡下觀察消化到適當(dāng)程度，用吸卵針將受精卵吸入Hepes-KSOM (H-KSOM) 中終止消化，輕輕吹打至胚胎完全脫去顆粒細(xì)胞，得到所需裸卵，H-KSOM中清洗3次，移入至少提前0.5 h平衡的KSOM[13]培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)體外培養(yǎng)得到各時(shí)期附植前胚胎。

1.3 電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎

使用Cy3標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA (10 μmol/L)電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠受精卵，此siRNA序列為19 bp隨機(jī)序列，與已知的小鼠、大鼠和人的基因無同源性，因此導(dǎo)入胚胎后對(duì)胚胎基因表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生影響。通過熒光倒置顯微鏡觀察分析轉(zhuǎn)染效果，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件和電穿孔參數(shù)。采用最佳實(shí)驗(yàn)條件和電穿孔參數(shù)轉(zhuǎn)染2-cell胚胎、4-cell胚胎、8-cell胚胎、桑椹胚和囊胚，觀察轉(zhuǎn)染效果。將采集的受精卵在PBS中清洗2次后移入臺(tái)氏液中靜置不同時(shí)間，用以不同程度地消化透明帶，計(jì)時(shí)結(jié)束后立即加入1 mL H-KSOM終止消化，然后吸出胚胎在PBS中清洗3次，最后用吸卵針將受精卵轉(zhuǎn)移至盛有opti-MEM的35 mm皿中清洗2遍后備用。按照 siPORT試劑說明書配置電穿孔溶液。50 μL opti-MEM加3 μL siPORT，室溫避光靜置10 min，siPORT的作用是可以與siRNA形成復(fù)合物，促進(jìn)siRNA在電轉(zhuǎn)染過程中更高效地進(jìn)入細(xì)胞。50 μL opti-MEM加 10 μL Cy3標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA。將稀釋的siPORT和稀釋的Cy3標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA按1∶1混合，輕輕抽吸混勻，室溫避光靜置10 min。將胚胎轉(zhuǎn)移至配置好的電穿孔溶液中，注意轉(zhuǎn)移胚胎時(shí)要求盡可能少吸液體，以避免稀釋電穿孔溶液。用吸卵針將含有胚胎的電穿孔溶液滴加至電轉(zhuǎn)槽正負(fù)電極縫隙間，均勻分散胚胎。選擇不同電壓，脈沖時(shí)間和脈沖次數(shù)進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染。完成轉(zhuǎn)染后吸出胚胎置于H-KSOM中清洗，熒光倒置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)染效果。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

使用臺(tái)氏液對(duì)胚胎透明帶進(jìn)行消化，消化時(shí)間設(shè)計(jì)為未進(jìn)行電轉(zhuǎn)的胚胎對(duì)照組，未經(jīng)消化對(duì)照組，消化10、20、30 s，電穿孔參數(shù)設(shè)定為10 V，1 ms，3次；電壓設(shè)計(jì)為10、20、30、40、50 V，臺(tái)氏液消化10 s，脈沖時(shí)間1 ms，3次；脈沖時(shí)間設(shè)計(jì)為600 μs、800 μs、1 ms、2 ms、3 ms，臺(tái)氏液消化10 s，電壓30 V，3次；脈沖次數(shù)設(shè)計(jì)為1、2、3、4次，脈沖間隔為儀器默認(rèn)間隔1 s。臺(tái)氏液消化10 s，電壓30 V，1 ms；以KSOM、PBS和opti-MEM分別作為電轉(zhuǎn)緩沖液，電穿孔參數(shù)設(shè)定為30 V，1 ms，3次。

1.5 轉(zhuǎn)染胚胎觀察

電穿孔后將胚胎用H-KSOM清洗后熒光顯微鏡下檢測(cè)存活率、轉(zhuǎn)染率和陽性存活胚胎囊胚率。先在明場(chǎng)下統(tǒng)計(jì)胚胎數(shù)目，固定視野轉(zhuǎn)換熒光光源，統(tǒng)計(jì)發(fā)出紅色熒光的胚胎數(shù)，在曝光時(shí)間為1 s時(shí)明顯觀察到紅色熒光的存活胚胎計(jì)為陽性轉(zhuǎn)染胚胎。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 原核胚透明帶消化時(shí)間對(duì)電穿孔效率的影響

未進(jìn)行消化處理的原核胚電穿孔后胚胎存活率較高，與消化 20 s實(shí)驗(yàn)組相比差異顯著(P＜0.05)，暗示對(duì)透明帶的消化處理在一定程度上可能會(huì)對(duì)胚胎的發(fā)育帶來不利影響。但與消化10 s實(shí)驗(yàn)組差異不顯著，這說明只要在適度的消化時(shí)間內(nèi)，透明帶弱化處理的過程對(duì)胚胎的影響是微弱的，不顯著的；使用臺(tái)氏液消化30 s后，透明帶變得很薄甚至完全被消化，電穿孔后熒光顯微鏡觀察顯示存活胚胎Cy3熒光陽性率，即轉(zhuǎn)染率 (85%) 顯著高于未消化組和消化 10 s組，與消化20 s實(shí)驗(yàn)組差異不顯著；胚胎消化30 s后胚胎存活率 (31%) 顯著低于其他3組(P＜0.05)；消化10 s和20 s實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染率無顯著差異，但兩組均顯著高于未處理組 (P＜0.05)；消化 10 s實(shí)驗(yàn)組陽性存活胚胎囊胚發(fā)育率顯著高于消化20 s和30 s實(shí)驗(yàn)組。另外未經(jīng)消化處理和電穿孔過程的胚胎在體外培養(yǎng)的囊胚率達(dá)到92%，顯著高于其他各組，包括未經(jīng)消化處理而只進(jìn)行電穿孔的實(shí)驗(yàn)組，這說明電穿孔過程中可能由于胚胎所處位置導(dǎo)致其所受場(chǎng)強(qiáng)不均等原因而不可避免地對(duì)少部分胚胎帶來不可恢復(fù)的損傷 (表1)。

圖1為不同實(shí)驗(yàn)組胚胎電穿孔后的顯微照片。A、D、G、J分別為明場(chǎng)下胚胎顯微照片，B、E、H、K分別為同一胚胎的紅色熒光照片，C、F、I、L為明場(chǎng)與熒光的合成照片。

2.2 電壓對(duì)電穿孔效率的影響

轉(zhuǎn)染率在30 V時(shí)達(dá)到最高 (95%)，與電壓10 V和20 V實(shí)驗(yàn)組差異顯著 (P＜0.05)，繼續(xù)增加電壓轉(zhuǎn)染率變化不大，但胚胎存活率和存活胚胎囊胚發(fā)育率急劇下降。電壓為 10、20、30 V 實(shí)驗(yàn)組間存活胚胎囊胚發(fā)育率差異不顯著 (表2)。

表1 透明帶消化時(shí)間對(duì)電穿孔效率的影響Table 1 Electroporation efficiency after different duration of digestion

圖1 不同消化時(shí)間的胚胎電穿孔后的紅色熒光水平Fig.1 Cy3 Fluorescence level in embryos when they were electroprated after different duration of digestion. Bar=40 μm. (A?C) Zona intact embryo. Fluorescence is present in the zona pellucida but not in the cytoplasm of the cell. (D?F) Duration of digestion was 10 s. (G?I) Duration of digestion was 20 s. (J?L) Duration of digestion was 30 s.

表2 電壓對(duì)電穿孔效率的影響Table 2 Electroporation efficiency at different voltages

2.3 脈沖時(shí)間對(duì)電穿孔效率的影響

胚胎存活率隨脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，脈沖時(shí)間為600 μs、800 μs和1 ms時(shí)差異不顯著，繼續(xù)延長(zhǎng)脈沖時(shí)間，存活率顯著下降 (P＜0.05)；轉(zhuǎn)染率隨脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，600 μs、800 μs和1 ms三個(gè)實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染率提高程度差異顯著，1 ms時(shí)轉(zhuǎn)染率最高達(dá)到93%，繼續(xù)增加脈沖時(shí)間轉(zhuǎn)染率無顯著提高，但存活胚胎囊胚發(fā)育率在2 ms和3 ms實(shí)驗(yàn)組中顯著降低 (P＜0.05) (表3)。

2.4 脈沖次數(shù)對(duì)電穿孔效率的影響

胚胎存活率隨著脈沖次數(shù)的增加而降低，但脈沖次數(shù)為1、2、3次時(shí)差異不顯著，脈沖次數(shù)為4次時(shí)，相比前3組胚胎存活率降低顯著(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染率隨著脈沖次數(shù)的增加而顯著提高 (P＜0.05)，脈沖次數(shù)增加到4次以后，轉(zhuǎn)染率提高不顯著；陽性轉(zhuǎn)染胚胎囊胚發(fā)育率隨脈沖次數(shù)的增加而降低，但相鄰兩實(shí)驗(yàn)組間囊胚率降低不顯著 (表4)。

2.5 電轉(zhuǎn)緩沖液對(duì)電穿孔效率的影響

使用KSOM、PBS和opti-MEM分別作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)，電穿孔后的胚胎存活率 3組間無顯著差異；使用opti-MEM作為電穿孔緩沖液時(shí)Cy3陽性轉(zhuǎn)染率最高，達(dá)到92%，使用 KOSM實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染率最低，3組間差異顯著 (P＜0.05)；使用 PBS作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)的陽性轉(zhuǎn)染存活胚胎的囊胚發(fā)育率顯著低于其他兩組。

2.6 電穿孔轉(zhuǎn)染其他時(shí)期胚胎

通過上述實(shí)驗(yàn)確定電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠受精卵條件為：臺(tái)氏液消化10 s，電穿孔參數(shù)為電壓30 V，脈沖時(shí)間1 ms，脈沖次數(shù)3次。使用此方法轉(zhuǎn)染小鼠其他時(shí)期胚胎，包括2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚。圖2為轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4 h熒光顯微鏡下觀察拍照照片。

表3 脈沖時(shí)間對(duì)電穿孔效率的影響Table 3 Electroporation efficiency of different pulse duration

表4 脈沖次數(shù)對(duì)電穿孔效率的影響Table 4 Electroporation efficiency of different number of pulse

表5 電轉(zhuǎn)緩沖液對(duì)電穿孔效率的影響Table 5 Electroporation efficiency of different electroporation buffers

圖2 電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠附植前各時(shí)期胚胎Fig. 2 Electroporation of mouse embryos in various stages with Cy3-labeled negative control siRNA. Bar=40 μm. (A?C) Embryos electroporated at 2-cell stage. (D?F) Embryos electroporated at 4-cell stage. (G?I) Embryos electroporated at 8-cell stage. (J?L) Embryos electroporated at morula stage. (M?O) Embryos electroporated at blastocyst stage.

3 討論

透明帶對(duì)于胚胎在體內(nèi)的正常發(fā)育是非常重要的[14-15]，然而將透明帶完整的胚胎，即實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中未處理的實(shí)驗(yàn)組胚胎直接用于電穿孔時(shí)轉(zhuǎn)染效率很低，并且通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)電穿孔后的胚胎在透明帶上有異常熒光亮點(diǎn)(圖1)，熒光直接反映的是所標(biāo)記的siRNA的位置，因此異常的熒光亮點(diǎn)說明siRNA很少能穿透透明帶進(jìn)入胚胎細(xì)胞內(nèi)部，而是在透明帶上形成聚集，造成假陽性轉(zhuǎn)染。

盡管去除透明帶，即消化30 s后的小鼠原核胚在體外培養(yǎng)中也能成功發(fā)育到囊胚，但是發(fā)育率顯著低于透明帶完整的胚胎 (表1)。并且去除透明帶的胚胎容易黏附于吸卵針管壁內(nèi)，在清洗和轉(zhuǎn)移過程中極易受到損傷，這也在一定程度上降低了胚胎利用率，增加了實(shí)驗(yàn)成本，因此盡管存活胚胎的Cy3陽性率即轉(zhuǎn)染率較高 (表1)，但我們依然放棄完全去除透明帶的方案。我們采用一方面對(duì)透明帶進(jìn)行適度弱化，另一方面提高電穿孔時(shí)的電壓，優(yōu)化脈沖時(shí)間和脈沖次數(shù)。Grabarek等[16]在使用電穿孔方法向胚胎導(dǎo)入dsRNA (double-stranded RNA ) 時(shí)采用10 V電壓，然而通過表2可以看出30 V電壓的胚胎存活率相比10 V有所降低，但是犧牲的存活率獲得的是顯著提高的陽性轉(zhuǎn)染率，這使得采用此方法進(jìn)行 RNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度大為增強(qiáng)。電壓再高，則轉(zhuǎn)染后的胚胎存活率會(huì)顯著降低[17]，這一點(diǎn)從表2中也可以看出。

脈沖時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有較大影響，脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)可以提高陽性轉(zhuǎn)染率，但是脈沖時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致胚胎局部過熱從而對(duì)胚胎造成不可恢復(fù)的損傷，同時(shí)在瞬時(shí)微孔的持續(xù)期間所引起的胚胎與電轉(zhuǎn)緩沖液之間的物質(zhì)交換，也可能造成胚胎內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的破壞，從而導(dǎo)致胚胎存活率下降[18]。脈沖時(shí)間太短則不能使足夠的 siRNA進(jìn)入胚胎內(nèi)部[19]。通過實(shí)驗(yàn)可以看出，脈沖時(shí)間從600 μs延長(zhǎng)至1 ms時(shí)，陽性轉(zhuǎn)染率逐漸增加。繼續(xù)延長(zhǎng)脈沖時(shí)間，轉(zhuǎn)染率提高不顯著，但是胚胎存活率開始顯著下降 (表3)。

實(shí)驗(yàn)證明大多數(shù)細(xì)胞在脈沖次數(shù)為2~4次的條件下可以取得較為理想的轉(zhuǎn)染效果。脈沖次數(shù)的增加一方面增加穿孔數(shù)量，另一方面脈沖次數(shù)的增加也提高了脈沖觸發(fā)電滲透、內(nèi)吞等運(yùn)輸方式的概率[20]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明 (表4)，對(duì)于弱化了透明帶的胚胎，在綜合考慮轉(zhuǎn)染效率、胚胎存活率和囊胚發(fā)育率的情況下，3次脈沖可以獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

我們也測(cè)試了幾種候選的電轉(zhuǎn)緩沖液。使用KSOM 培養(yǎng)液直接作為電轉(zhuǎn)緩沖液用于電穿孔時(shí)，在兩電極間產(chǎn)生大量絮狀沉淀，這在很大程度上降低了胚胎對(duì)siRNA的攝入；使用PBS作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)有少量沉淀，且存活胚胎的囊胚發(fā)育率極低，原因可能是胚胎受電擊后產(chǎn)生的瞬時(shí)微孔使緩沖液組分能直接進(jìn)入胚胎內(nèi)，因此使用與細(xì)胞質(zhì)組分差異較大的緩沖液會(huì)造成胚胎發(fā)育率降低；使用opti-MEM作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)未觀察到明顯沉淀物生成，且電轉(zhuǎn)后胚胎發(fā)育形態(tài)良好。

由此我們確定了通過電穿孔方法向小鼠受精卵導(dǎo)入siRNA的技術(shù)路線，即首先使用臺(tái)氏液對(duì)胚胎透明帶進(jìn)行弱化處理，消化時(shí)間為10 s。進(jìn)而對(duì)透明帶弱化后的胚胎進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)緩沖液使用opti-MEM并結(jié)合siPORT轉(zhuǎn)染試劑，電穿孔參數(shù)設(shè)定為電壓30 V，脈沖時(shí)間1 ms，脈沖次數(shù)3次。使用此方法又轉(zhuǎn)染了小鼠附植前其他時(shí)期胚胎，包括2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚，均取得良好效果，胚胎發(fā)育形態(tài)也未觀察到任何異常?？傊?，本研究建立并優(yōu)化了一種 siRNA簡(jiǎn)便、高效轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎的方法，為采用由siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究基因在小鼠附植前胚胎中的功能提供了技術(shù)參考。

[1] Lipardi C, Wei Q, Paterson BM. RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs. Cell, 2001, 107 (3) : 297?307.

[2] Hutvágner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, et al. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science, 2001, 293 (5531) : 834?838.

[3] Chua KY, Ramos JDA, Cheong N. Production of monoclonal antibody by DNA immunization with electroporation. Methods Mol Biol, 2008, 423: 509?520.

[4] Tjelle TE, Rabussay D, Ottensmeier C, et al. Taking electroporation-based delivery of DNA vaccination into humans: a generic clinical protocol. Methods Mol Biol, 2008, 423: 497?507. [5] Zhao YG, Xu YH. Electroporation-mediated HBV DNA vaccination in primate models. Methods Mol Biol, 2008, 423: 487?495.

[6] Volkov AG, Paula S, Deamer DW. Two mechanisms of permeation of small neutral molecules and hydrated ions across phospholipid bilayers. Bioelectrochem Bioenerg, 1997, 42 (2) : 153?160.

[7] Pliquett UF, Gusbeth CA. Perturbation of human skin due to application of high voltage. Bioelectrochemistry, 2000, 51 (1) : 41?51.

[8] Fei ZZ, Wang SN, Xie YB, et al. Gene transfection of mammalian cells using membrane sandwich electroporation. Anal Chem, 2007, 79 (15) : 5719?5722.

[9] Yao SM, Rana S, Liu DW, et al. Electroporation optimization to deliver plasmid DNA into dental follicle cells. Biotechnol J, 2009, 4 (10) : 1488?1496.

[10] Barry BW. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. Eur J Pharm Sci, 2001, 14 (2) : 101–114.

[11] Osumi N, Inoue T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods, 2001, 24 (1) : 35–42.

[12] Gagné MB, Pothier F, Sirard MA. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes. Mol Reprod Dev, 1991, 29 (1) : 6?15.

[13] Lawitts JA, Biggers JD. Optimization of mouse embryo culture media using simplex methods. J Reprod Fertil, 1991, 91 (2) : 543–556.

[14] Bronson RA, McLaren A. Transfer to the mouse oviduct of eggs with and without the zona pellucida. J Reprod Fertil, 1970, 22 (1) : 129–137. [15] Modliński JA. The role of the zona pellucida in the development of mouse eggs in vivo. J Embryol Exp Morphol, 1970, 23 (3) : 539–547.

[16] Grabarek JB, Plusa B, Glover DM, et al. Efficient delivery of dsRNA into zona-enclosed mouse oocytes and preimplantation embryos by electroporation. Genesis, 2002, 32 (4) : 269–276. [17] Hui SW. Effects of pulse length and strength on electroporation efficiency. Methods Mol Biol, 1995, 48 (Pt 1) : 29?40.

[18] Van den Hoff MJ, Christoffels VM, Labruyère WT, et al. Electrotransfection with “intracellular” buffer. Methods Mol Biol, 1995, 48 (Pt II) : 185?197.

[19] Zald PB, Cotter MA, Robertson ES. Strategy for increased efficiency of transfection in human cell lines using radio frequency electroporation. Prep Biochem Biotechnol, 2001, 31 (1) : 1?11.

[20] DeBruin KA, Krassowska W. Modeling electroporation in a single cell. I. effects of field strength and rest potential. Biophys J, 1999, 77 (3) : 1213?1224.