生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-塔格糖的食品級(jí)菌種選育及L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的克隆表達(dá)

門燕，朱玥明，管于平，張同存，何森健，孫媛霞

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

遠(yuǎn)在公元前 16世紀(jì)，中國(guó)就會(huì)利用微生物釀酒，微生物發(fā)酵方法至今仍應(yīng)用于食品加工中，如醋、醬油、酸奶等制造業(yè)。該類微生物 被 稱 為 食 品 級(jí) 微 生 物 (Food-grade microorganisms)，屬于一般公認(rèn)安全 (Generally recognized as safe，GRAS) 微生物范疇。這類食品級(jí)微生物主要有：真菌中的曲霉菌和酵母菌，細(xì)菌中的乳酸菌和枯草芽胞桿菌等[1]，這些微生物在食品工業(yè)中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

D-塔格糖 (D-果糖同分異構(gòu)體) 是目前被發(fā)現(xiàn)的一種新型的低熱量的功能性甜味劑[2]。D-塔格糖的味道和口感與蔗糖相似，但是 D-塔格糖的熱量值僅有7.3 kJ/g，只占蔗糖能量的30%[3]。對(duì)于血糖醫(yī)學(xué)指數(shù)的研究表明，D-塔格糖不會(huì)引起血液中葡萄糖水平的增加，因此D-塔格糖的使用對(duì)于糖尿病患者是安全的[4-5]；不同于蔗糖，它不會(huì)促進(jìn)蛀牙生長(zhǎng)，并具有抑制齲齒、牙齦炎、消除口臭及潔齒等作用[6-7]。2001年美國(guó)食品與藥物管理局 (FDA) 確定 D-塔格糖為普遍公認(rèn)安全食品 (GRAS)[8]。

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶 (L-arabinose isomerase，L-AI) 是一種能夠催化 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為 L-核酮糖的異構(gòu)化酶，由于D-半乳糖和L-阿拉伯糖在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，其在C3、C4的位置上均有一個(gè) L-型順式羥基結(jié)構(gòu)，因此在體外L-AI能使D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖[3,9-11]。由此可見(jiàn)L-AI是實(shí)現(xiàn)生物法生產(chǎn)D-塔格糖的重要生物催化劑[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，L-AI對(duì)D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)溫度的升高而增加，因此以往篩選得到的多來(lái)源于嗜熱菌，例如嗜熱桿菌Thermoanaerobacter mathrani[13]，嗜熱脂肪芽胞桿菌 Bacillus stearothermophilus US100[14]等。但這些嗜熱菌及其來(lái)源基因的食品安全性受到質(zhì)疑，研究學(xué)者開(kāi)始篩選食品級(jí)微生物開(kāi)展轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-塔格糖的研究，Cheetham等[15]利用蓋氏乳桿菌Lactobacillus gayonii代謝產(chǎn)生 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶成功轉(zhuǎn)化半乳糖生成塔格糖，第一次提出利用乳酸菌生產(chǎn)塔格糖的設(shè)想。Chouayekh，Zhang H等[16-17]利用來(lái)自于植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum 的L-AI的基因克隆表達(dá)進(jìn)行半乳糖的轉(zhuǎn)化成為塔格糖。Rhimi等[18]在食品級(jí)基礎(chǔ)上克隆表達(dá)了來(lái)自于米酒乳桿菌Lactobacillus sakei 23K的耐酸L-AI基因，利用酶法轉(zhuǎn)化生成了塔格糖。還有2011 年來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌 Lactobacillus fermentum[19]等食品級(jí)菌株L-AI的應(yīng)用的報(bào)道。

本研究通過(guò)食品級(jí)菌種的篩選，從各種酸奶泡菜制品中篩選出一株產(chǎn) L-AI的菌株，將其L-AI基因克隆，構(gòu)建質(zhì)粒，并成功表達(dá)了具有生物活性的重組L-AI，利用微生物酶法轉(zhuǎn)化生成塔格糖，為更進(jìn)一步通過(guò)定點(diǎn)突變和基因重組的手段研究生物轉(zhuǎn)化法制備 D-塔格糖提供新材料，開(kāi)拓新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與培養(yǎng)基

從各種酸奶制品、泡菜以及其他一些食品中采集不同的樣品，將上述樣品培養(yǎng)在MRS固體培養(yǎng)基平板上，涂布、劃線分離。

1) 改良肉湯培養(yǎng)基 (MRS)[20]：蛋白胨l0.0 g；牛肉膏10.0 g；酵母粉5.0 g；乙酸鈉5.0 g；檸檬酸三銨 2.0 g；磷酸氫二銨 2.0 g；MgSO4·7H2O：0.58 g；MnSO4·H2O∶0.25 g；吐溫-80 1 mL；蒸餾水1000 mL；葡萄糖2%，為避免葡萄糖高溫滅菌時(shí)發(fā)生一定程度的焦化，配制培養(yǎng)基時(shí)，單獨(dú)將其配置成20%的糖溶液。待培養(yǎng)基完全溶解，調(diào)pH至6.2~6.6。

2) 平板及斜面培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂。

1.1.2 菌種與質(zhì)粒

作為質(zhì)?？寺〉乃拗骶竽c桿菌Escherichia coli DH5α、目的基因表達(dá)的宿主菌E. coli BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆以及表達(dá)載體pET-21a (+)購(gòu)自Novagen公司。

1.1.3 生化試劑

PCR引物由華大基因合成 (表1)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自于寶生物工程有限公司。

表1 16S rDNA通用引物序列和PCR擴(kuò)增L-AI的引物序列Table 1 The general primers of 16S rDNA and PCR amplification primers of L-AI gene

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩

將篩得的菌株，分別接種到裝有100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，將發(fā)酵液等量分裝于 2個(gè)離心管中，其中一管離心20 min (4 ℃，12 000 r/min) 獲得菌體，懸浮于2 mL ddH2O中，超聲破碎5 min后，離心去除細(xì)胞碎片，取上清液 (即為粗酶液) 進(jìn)行酶反應(yīng)。酶促反應(yīng)條件為：取500 μL粗酶液與500 μL 1%D-半乳糖，35 ℃反應(yīng)過(guò)夜。

另一管未做細(xì)胞破碎的菌體離心棄上清后直接進(jìn)行酶反應(yīng)。酶反應(yīng)條件為：加入500 μL 1%D-半乳糖液以及500 μL ddH2O，35 ℃反應(yīng)過(guò)夜。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

酶反應(yīng)結(jié)束后，加熱至95 ℃、5 min終止反應(yīng)，采用半胱氨酸-咔唑法[21]進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

將篩得的菌株根據(jù)參考文獻(xiàn)[22]所列乳酸菌種鑒定方法進(jìn)行鑒定。

1.2.3 16S rDNA克隆及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的建立

以基因組DNA為模板，利用16S rDNA基因的通用引物 (Lac-F、Lac-R)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序。

PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.4 Pediococcus pentosaceus PC-5 L-AI基因序列擴(kuò)增

根 據(jù) NCBI 基 因 庫(kù) 中 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 (GenBank Accession No. CP000422.1) 菌中的L-AI基因序列設(shè)計(jì)引物(PPAI-F、PPAI-R)，上下游引物 5'端分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 Pediococcus pentosaceus PC-5 L-AI基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

純化后的L-AI的PCR基因片段和表達(dá)載體pET-21a (+) 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)?；厥蘸蟮哪康钠闻c載體用T4 DNA連接酶在4 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)中進(jìn)行克隆，PCR篩選陽(yáng)性克隆，雙酶切鑒定，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入E. coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將重組質(zhì)粒送華大基因測(cè)序。

1.2.6 重組L-AI的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽(yáng)性菌落E. coli BL21 (pET-PPLAI)接入 3 mL LB-Amp培養(yǎng)基 (Amp終濃度為100 mg/L) 中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，將上一步活化的菌接種至 100 mL LB-Amp培養(yǎng)基(Amp終濃度為100 mg/L) 中，37 ℃培養(yǎng)3~4 h至OD600約0.6~0.8，即細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，加入IPTG (終濃度0.5 mmol/ L) 誘導(dǎo)表達(dá)，分別以37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h，20 ℃、100 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。

收集誘導(dǎo)后的菌體，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清，并用ddH2O洗滌菌體2次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清，用2 mL ddH2O懸浮，并在冰上超聲破碎細(xì)胞，離心20 min，取上清液50 μL，加入50 μL 2×SDS上樣緩沖液，用于SDS-PAGE檢測(cè)。同時(shí)將只含有pET-21a (+) 的E. coli BL21進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)操作作為對(duì)照。

1.2.7 重組L-AI粗酶的酶活檢測(cè)

L-AI的活性通過(guò)D-塔格糖生成的含量來(lái)測(cè)定。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，反應(yīng)體系包括：1%D-半乳糖，0.5 mmol/L CoCl2，1 mmol/L MnCl2，300 μL粗酶，用 ddH2O補(bǔ)足至 1 mL (對(duì)照反應(yīng)不加MnCl2測(cè)酶活力)。酶促反應(yīng)在30 ℃、40 ℃恒溫下過(guò)夜，在100 ℃水浴中處理5 min滅活酶的活性停止反應(yīng)。生成的D-塔格糖的含量采用HPLC高效液相色譜法。安捷倫高效液相色譜儀1200，分析柱：Waters Sugar Pak1，流動(dòng)相：去離子水，柱溫80 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器：示差檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩結(jié)果

采用半胱氨酸-咔唑法，對(duì)篩出的20株菌株進(jìn)行顯色反應(yīng)。對(duì)于菌體超聲破碎獲得的上清液進(jìn)行的酶反應(yīng)，通過(guò)顏色比較，顯色結(jié)果并不理想，但在分光光度計(jì)測(cè)出在560 nm下有一株菌顯示較小的吸光值，顯示出弱的L-AI活性，將其初步確定為具有產(chǎn)塔格糖能力的菌株，命名為PC-5菌株；對(duì)于所有用全細(xì)胞進(jìn)行的酶促反應(yīng)來(lái)說(shuō)，均沒(méi)有檢測(cè)到酶活。

2.2 菌株的細(xì)胞形態(tài)及生理生化鑒定

菌株在液體MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，細(xì)菌生長(zhǎng)狀況良好，菌體呈白色，并沉降在培養(yǎng)基的底部。菌體在固體 MRS培養(yǎng)基中37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，菌落圓形，白色扁平，邊緣圓整。由革蘭氏染色結(jié)果可知，該P(yáng)C-5菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞形狀呈球形，呈片狀排列，直徑0.8~1.0 μm。同時(shí)，在表2中也比較了PC-5菌株與相關(guān)菌株的生理生化特性，其結(jié)果顯示PC-5菌株與P. pentosaceus[22]的相關(guān)生理生化特征較為相似，接觸酶均為陰性；不能水解淀粉；明膠液化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；均可利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、柳醇作為碳源。據(jù)此鑒定PC-5菌株屬于片球菌屬。

2.3 菌株16S rDNA基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)分析測(cè)定獲得該片段序列，利用BLAST軟件將該序列與美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI) 收錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，基于相關(guān)菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖1)。結(jié)果表明，PC-5菌株16S rDNA序列與Pediococcus pentosaceus屬的相似性最高。根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果，結(jié)合其形態(tài)和生理生化特性，該菌被鑒定為Pediococcus pentosaceus，并將該菌株命名為Pediococcus pentosaceus PC-5。

2.4 PC-5菌L-AI基因的擴(kuò)增

從 NCBI上查得 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 (GenBank Accession No. CP000422.1) 此菌株含有表達(dá)L-AI的基因序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，則以PC-5菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增L-AI基因。從PC-5菌中擴(kuò)增出大小約為1 400 bp的DNA片段，與L-AI基因的已知大小相符。

表2 PC-5菌株及相關(guān)菌株的特征比較Table 2 Comparison of the phenotypic characteristics of strain PC-5 and the related strains

2.5 L-AI基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

重組質(zhì)粒經(jīng) BamHⅠ和 Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證與菌落 PCR驗(yàn)證，結(jié)果均獲得目的基因片段1 400 bp左右 (圖2、3)，表明含L-AI基因的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果顯示，Pediococcus pentosaceus PC-5菌株的L-AI序列結(jié)果顯示目的基因片段的大小為1 426 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。將該基因序列提交至GenBank，獲取登錄號(hào)為：JN377428。

2.6 重組L-AI基因的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

將重組質(zhì)粒pET-PPLAI轉(zhuǎn)入表達(dá)載體E. coli BL21，選取陽(yáng)性菌落加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)，利用相同條件培養(yǎng)含有 pET-21a (+) 的E. oli BL21作為對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E. coli BL21 (pET-PPLAI)培養(yǎng)液在加入IPTG后，20 ℃、100 r/min過(guò)夜培養(yǎng)為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，由 SDS-PAGE可知(圖4)，重組蛋白粗提物在58 kDa 附近有一明顯的特異性條帶，對(duì)照菌的蛋白粗提物在該位置無(wú)明顯條帶。在此條件下重組蛋白以可溶性形式存在，幾乎沒(méi)有包涵體的生成。利用DNAMAN軟件計(jì)算出實(shí)際PPLAI理論值為54 kDa，與預(yù)期結(jié)果幾乎為一致。

2.7 重組L-AI粗酶的酶活

將重組L-AI進(jìn)行酶促反應(yīng)后，由HPLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，在1% D-半乳糖，300 μL粗酶提取物的反應(yīng)體系下，未加Mn2+的反應(yīng)體系結(jié)果在 16.49 min沒(méi)有峰出現(xiàn) (D-塔格糖的保留時(shí)間)，該結(jié)果與以往多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中指出“在沒(méi)有金屬離子存在的情況下，L-AI一般是沒(méi)有或者極低地顯示出異構(gòu)化 D-半乳糖的活性[23]”，“L-AI多數(shù)依賴Co2+、Mn2+作為輔因子增強(qiáng)其酶活力及熱穩(wěn)定性[14]”的結(jié)果一致，金屬離子Mn2+的攝入對(duì)于重組L-AI的酶促反應(yīng)的進(jìn)行是必需的。由色譜圖分析可見(jiàn) (圖 5)，從Pediococcus pentosaceus PC-5獲得的L-AI具有催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的能力，且轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)溫度的增加而提高，30 ℃、40 ℃反應(yīng)過(guò)夜 12 h，底物 1%D-半乳糖轉(zhuǎn)化率分別約為30%和33%。

圖1 PC-5菌株與其他細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogennetic relationships of 16S rDNA gene of PC-5 and related species.

圖2 重組pET-PPLAI的酶切驗(yàn)證Fig. 2 Identification of positive plasmid of pET-PPLAI by enzyme digestion. M: DNA marker; 1: L-AI; 2: pETPPLAI; 3: pET-21a (+).

圖3 重組pET-PPLAI的PCR驗(yàn)證Fig. 3 Identification of positive plasmid of pET-PPLAI by PCR. M: DNA marker; 1: PCR product of pET-PPLAI; 2: PCR product of pET-21a (+).

圖4 重組質(zhì)粒pET-PPLAI在E. coli BL21中的表達(dá)Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins expressed in E. coli BL21. M: protein markers; 1: total cell (pET-21a (+) without IPTG); 2: total cell (pET-21a (+) with IPTG); 3: supernatant (pET-21a (+)); 4: precipitation (pET-21a (+)); 5: total cell (pET-PPLAI without IPTG); 6: total cell (pET-PPLAI with IPTG); 7: supernatant (pET-PPLAI); 8: precipitation (pET- PPLAI).

圖5 HPLC分析D-塔格糖的產(chǎn)量Fig. 5 HPLC analysis of the D-tagatose production. (A) Standard solution of D-galactose and D-tagatose at 10 g/L. (B) Isomerization products after 12 h of reaction at 30 °C. (C) Isomerization products after 12 h of reaction at 40 °C. 1: D-Galactose with a retention time of 13.81 min; 2: D-tagatose with a retention time of 16.49 min.

3 結(jié)論

本研究采用了半胱氨酸咔唑法初步篩選出具有轉(zhuǎn)化生產(chǎn)塔格糖能力的食品級(jí)菌株，確定為戊糖片球菌，并將其L-AI基因在E. coli BL21異源表達(dá)。經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后, 約在58 kDa處明顯出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果幾乎相符，由SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，在此條件下重組蛋白以可溶性形式存在，幾乎沒(méi)有包涵體的生成。在溫度40 ℃，1%底物、300 μL粗酶的條件下反應(yīng)過(guò)夜，以半乳糖為底物轉(zhuǎn)化為塔格糖，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到33%。目前，利用食品級(jí)菌株微生物酶法將半乳糖轉(zhuǎn)化為塔格糖，在食品工業(yè)上廣泛應(yīng)用。對(duì)此，我們將由戊糖片球菌獲得的重組酶的純化以及提高塔格糖的產(chǎn)率作為下一步工作的重點(diǎn)方向。

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