基于代謝流量分布信息理解大腸桿菌中異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)因子的代謝調(diào)控作用

柳志杰，周利，花強(qiáng)

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

基因的表達(dá)是通過不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來調(diào)控的，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是一類能結(jié)合在DNA特定序列上的蛋白。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合在DNA特定序列上就能促進(jìn)或者抑制RNA聚合酶 (RNAP)的結(jié)合能力。RNA聚合酶 (RNAP) 親和力的降低一般會降低基因的表達(dá)，而RNAP親和力的提高一般會加強(qiáng)基因的表達(dá)。大腸桿菌中的異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)因子 (IclR) 能夠抑制 aceBAK操縱子的表達(dá)，aceBAK操縱子編碼乙醛酸支路的3個酶：異檸檬酸裂解酶 (由aceA基因編碼)、蘋果酸合酶 (由 aceB基因編碼) 和異檸檬酸脫氫酶 (IDH) 激酶/磷酸酶 (由aceK基因編碼)。乙醛酸支路使得大腸桿菌能夠在乙酸或脂肪酸上生長。乙醛酸支路是大腸桿菌在這些碳源 (乙酸、脂肪酸) 上生長時的必需途徑，因?yàn)樗苊饬颂荚油ㄟ^三羧酸循環(huán)而以兩分子 CO2的形式失去。乙醛酸支路激活時，異檸檬酸在異檸檬酸裂解酶催化下裂解形成乙醛酸和琥珀酸，琥珀酸可以重新進(jìn)入三羧酸循環(huán)，乙醛酸和乙酰輔酶A在蘋果酸合酶的催化下形成蘋果酸[1]。乙醛酸支路的第3個酶——異檸檬酸脫氫酶 (IDH) 激酶/磷酸酶具有雙重功能，它通過磷酸化和去磷酸化異檸檬酸脫氫酶作用來控制異檸檬酸的流向[2]。

從上世紀(jì)90年代，代謝工程作為一門新的學(xué)科被提出以來[3]，代謝工程已經(jīng)成當(dāng)前國際生物技術(shù)領(lǐng)域的一個新的研究前沿。代謝流量分析作為代謝工程的一個主要的分析工具[3-4]，其結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)整個中心代謝途徑的代謝速率，也即為流量。代謝流量分析可以用來闡明細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制、提高生物生產(chǎn)過程的產(chǎn)量、注釋未知的基因、分析藥物的毒性等[5-8]。近年來，基于穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記碳源的代謝流量分析方法已經(jīng)成功地被應(yīng)用于分析多種微生物，如大腸桿菌[9-12]、集胞藻[13]、酵母菌[14]和琥珀酸放線桿菌[15-16]等。

13C代謝流量分析實(shí)驗(yàn)流程為：在培養(yǎng)基中添加穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記的底物，如首位13C標(biāo)記的葡萄糖 (1-13C-glucose) 或均勻13C標(biāo)記的葡萄糖 (U-13C-glucose) 等，當(dāng)細(xì)胞代謝這些13C標(biāo)記的底物時，底物上的同位素標(biāo)記信息會隨代謝反應(yīng)從不同方向傳遞到代謝網(wǎng)絡(luò)的各個中間代謝物上，進(jìn)而傳遞到蛋白氨基酸上。菌體蛋白氨基酸含量豐富，提取方便，且這些氨基酸是由一些關(guān)鍵的中間代謝物合成的，根據(jù)它們的同位體分布信息可以推導(dǎo)得到中間代謝物的同位體分布信息[17]，并借助代謝流比率方法來進(jìn)行代謝流量的定量解析[18]。

當(dāng)前，對細(xì)胞的中心代謝途徑基因的代謝調(diào)控研究得比較多，但對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的代謝調(diào)控機(jī)理研究得則相對較少。本文主要應(yīng)用13C代謝流量分析來研究iclR基因敲除對大腸桿菌BW25113生理和代謝的影響，進(jìn)而揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞代謝調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E. coli BW25113、E. coli BW25113 ΔiclR，由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。iclR基因敲除的大腸桿菌菌株 E. coli BW25113 ΔiclR是在原始菌E. coli BW25113染色體上敲除了iclR基因。

1.1.2 主要試劑及儀器

均勻13C標(biāo)記的葡萄糖 (U-13C-glucose，pu＞99%)、首位13C標(biāo)記的葡萄糖 (1-13C-glucose，p1＞99%)、N,N-二甲基甲酰胺和衍生劑N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺均購自 Sigma公司。其他試劑均為分析純。高效液相色譜 (HPLC)為 Agilent 1200型液相。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)為 Agilent 6890GC-5975MS型氣質(zhì)聯(lián)用儀。酶標(biāo)儀為BioTek Power Wave XS2型酶標(biāo)儀。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為M9合成培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖3 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，(NH4)2SO42.7 g/L，Na2HPO46.8 g/L，KH2PO43.0 g/L，NaCl 0.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，維生素B1 1.0 μg/L，微量元素溶液 10 mL/L；微量元素溶液組成為：CaCl2·2H2O 0.55 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 1.67 g/L，MnCl2·4H2O 0.10 g/L， ZnCl20.17 g/L，CuCl2·2H2O 0.04 g/L，CoCl2·6H2O 0.06 g/L，Na2MoO4·4H2O 0.06 g/L。

1.2 培養(yǎng)條件及標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

菌株均在37 ℃、220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)簡單易行，在指數(shù)生長期，細(xì)胞快速地消耗營養(yǎng)源用于新細(xì)胞體的合成，胞內(nèi)代謝物幾乎沒有積累，該時期的細(xì)胞代謝處于擬穩(wěn)態(tài)過程，可以對這樣的過程進(jìn)行基于穩(wěn)定同位素的代謝流量解析。標(biāo)記實(shí)驗(yàn)用20% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 均勻13C標(biāo)記的葡萄糖和 80% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 天然的葡萄糖或者20% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 首位13C標(biāo)記的葡萄糖和80% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 天然的葡萄糖。菌株經(jīng)過活化后接種于新鮮的M9合成培養(yǎng)基中。取指數(shù)生長中期的細(xì)胞用于細(xì)胞內(nèi)流量分析和酶活性測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 生理參數(shù)的確定

1.3.1 細(xì)胞濃度的測定

將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后于波長600 nm處測定吸光值OD600，通過OD600的變化來監(jiān)測菌體生長情況。

1.3.2 細(xì)胞干重的測定

取一定量體積的發(fā)酵液，在4 ℃下12 000×g離心10 min，用去離子水洗2次后置于85 ℃烘箱中烘至恒重，稱重。

1.3.3 葡萄糖的檢測

HPLC檢測。檢測器：示差折光檢測器；色譜柱：NH2柱；流動相：乙腈+水 (80∶20)，流速1 mL/min；檢測器池溫度：40 ℃；柱溫：40 ℃。

1.3.4 有機(jī)酸的檢測

HPLC檢測。檢測器：紫外檢測器；色譜柱：ODS柱；流動相：0.1% H3PO4，流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.3.5 生理參數(shù)的計算

基于菌體濃度、葡萄糖濃度和有機(jī)酸濃度的變化，可以計算得到指數(shù)生長期細(xì)胞的比生長速率 (μ)、菌體得率 (YX/S)、底物的比消耗速率 (qS)和產(chǎn)物的比生成速率 (qP)[19]。

1.4 GC-MS樣品的準(zhǔn)備及分析

1.4.1 GC-MS樣品的準(zhǔn)備

收集指數(shù)生長中期的菌體細(xì)胞，用 0.9% NaCl溶液清洗3次，在200 μL 6 mol/L HCl 中105 ℃水解16 h。水解產(chǎn)物于60 ℃真空干燥烘干，加100 μL N,N-二甲基甲酰胺和50 μL N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺85 ℃衍生1 h，衍生化的樣品過濾后用于GC-MS分析[12]。

1.4.2 GC-MS樣品的分析

氣相色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm× 0.25 μm)。升溫程序：150 ℃保留2 min，以5 ℃/min升到180 ℃，然后以10 ℃/min升到260 ℃，保留 8 min；載氣 (氦氣，純度≥99.996%) 流速為1 mL/min；進(jìn)樣量：0.2 μL；分流比：1∶100；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，離子源溫度：230 ℃；?70 eV轟擊；質(zhì)譜儀掃描范圍：70~560 m/z；溶劑延遲：5 min。

1.5 細(xì)胞代謝流量的定量計算

為了計算菌體細(xì)胞體內(nèi)的代謝流量，我們根據(jù)大腸桿菌主要的中心代謝途徑建立了大腸桿菌的代謝模型，包括29步代謝反應(yīng)和24個代謝物。在這種情形下，此代謝模型為未定系統(tǒng)。為了模型可解，我們可以利用實(shí)驗(yàn)測得的代謝物同位體分布信息來分析代謝途徑的流量比率，進(jìn)而基于細(xì)胞代謝物的平衡式以及推導(dǎo)得到的代謝流量比率即可進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)流量的定量化分析[18]。

水解得到的蛋白氨基酸經(jīng)過叔丁基二甲基硅烷化合物 (TBDMS) 衍生化處理，所得到的氨基酸衍生物就能夠在氣相色譜上得到很好的分離，在其后的質(zhì)譜儀中，衍生化的氨基酸在電子轟擊離子化作用下斷裂成帶有不同碳原子骨架片段的氨基酸碎片，并且這些碎片根據(jù)質(zhì)荷比的不同而得到分離[20-21]。

對于質(zhì)譜得到的每個帶有不同碳原子骨架片段的氨基酸碎片，其質(zhì)量分布矢量MDV可以通過公式1獲得[22]。

m0表示不含13C標(biāo)記的氨基酸碎片的豐度，mi>0表示i個碳原子被13C標(biāo)記的氨基酸碎片的豐度。

由于自然界中各種元素的自然豐度會對得到的氨基酸碎片的質(zhì)量分布矢量 MDVα產(chǎn)生影響。為了得到純粹的氨基酸碳骨架的同位體質(zhì)量分布矢量，MDVα需要校正掉衍生化氨基酸片段上的所有氫、氧、氮、硫、硅元素，以及衍生基團(tuán)上的碳元素的自然豐度。這可以通過公式2進(jìn)行校正[22]。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的氨基酸碎片的質(zhì)量分布矢量我們即可計算出一些節(jié)點(diǎn)的代謝流比率。在本研究中，乙醛酸支路是關(guān)鍵的調(diào)控途徑，F(xiàn)isher等研究中僅給出了最終的計算式[23]，為了幫助理解，在這里給出其具體推導(dǎo)過程。目標(biāo)代謝物OAA的C1到C4片段 (其質(zhì)量分布矢量表示為OAA1_4) 在羧化反應(yīng)中是由PEP的C1到C3片段和一分子 CO2得到 (其質(zhì)量分布矢量表示為PEP1-3_CO2)， 在 乙 醛 酸 支 路 中 的 由 來(OAA_GOX) 一半為 ACA的 C1到 C2片段(ACA1_2) 和OAA的C1到C2片段 (OAA1_2) 得到 (即ACA1_2×OAA1_2)，另一半為ACA的C1到C2片段和OAA的C3到C4片段 (OAA3_4) 得到(即ACA1_2×OAA3_4)。因此能夠得到下式：

PEP1-3_CO2的計算方法可以參考筆者的另一篇文章[18]。ACA1_2可以由丙氨酸的C2到C片段的質(zhì)量分布矢量得到，OAA1_2可以由天冬氨酸的C1到C2片段的質(zhì)量分布矢量得到，OAA1_可以由天冬氨酸的C1到C4片段的質(zhì)量分布矢量得到，OAA3_4可以由OAA1_2和OAA1_4擬合得到?？紤]OAA由乙醛酸支路得到的上限，OAA1_4PEP1-3_CO2和OAA_GOX之間的關(guān)系為：化簡整理可得，來自于乙醛酸支路的OAA比率的上限為：

由得到的氨基酸片段的質(zhì)量分布矢量 MDV可以計算得到中間代謝物的質(zhì)量分布矢量MDV，由此可以計算得到中心代謝網(wǎng)絡(luò)在關(guān)鍵代謝物節(jié)點(diǎn)處的代謝流比率。以這些流量比率數(shù)據(jù)為輔助限制條件，結(jié)合代謝物的質(zhì)量平衡關(guān)系等[24]，由MATLAB即可定量計算出細(xì)胞中心代謝途徑的代謝流量。

1.6 酶活性的測定

用于酶活測定的細(xì)胞裂解緩沖液組成：200 mmol/L Tris-HCl (pH 7)，4 mmol/L氯化鎂和2 mmol/L二硫蘇糖醇。

大腸桿菌酶液的制備：收集指數(shù)中期的細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心5 min收集菌體，用裂解緩沖液洗2次，然后懸浮在裂解緩沖液中，進(jìn)行超聲裂解，超聲破碎條件：電壓100 V，每超聲3 s，間隔10 s，超聲20次。超聲裂解液在4 ℃、12 000×g離心5 min，上清液作為大腸桿菌粗酶液，測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。上清液保存于?80 ℃的冰箱。

異檸檬酸裂解酶酶活性的測定[21]：反應(yīng)基于異檸檬酸裂解酶催化的產(chǎn)物——乙醛酸和苯肼反應(yīng)生成苯腙類物質(zhì)，該物質(zhì)在324 nm處有吸收峰。反應(yīng)體系為100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 7)、6 mmol/L氯化鎂、4 mmol/L苯肼、12 mmol/L L-半胱氨酸和8 mmol/L異檸檬酸三鈉。反應(yīng)溫度：30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 iclR基因敲除對菌株生理學(xué)特性的影響

大腸桿菌原始菌和突變株的生長特性見表1。

由表1可以看出，大腸桿菌原始菌和突變株的最大比生長速率分別為0.61 h?1和0.58 h?1，iclR基因的敲除使大腸桿菌的最大比生長速率下降了5%，同時降低的還有葡萄糖的比消耗速率、乙酸的比生成速率以及乙酸得率，下降幅度分別是7%、11%和7%。大腸桿菌原始菌和突變株的菌體得率分別為 0.35 g DCW/g葡萄糖和0.37 g DCW/g葡萄糖，相對于原始菌株而言，iclR基因的敲除使突變株的菌體得率略有提高。

2.2 iclR基因敲除對細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中代謝流量比率的影響

大腸桿菌原始菌和突變株的部分TBDMS衍生化蛋白氨基酸的質(zhì)量同位素分布見表2和表3。

表1 原始菌和突變株指數(shù)生長期的生長特性Table 1 Physiological characteristics of exponentially grown BW25113 and BW25113 ΔiclR

表2 大腸桿菌原始菌TBDMS衍生化蛋白氨基酸的質(zhì)量同位體分布 (已校正)Table 2 Mass isotopomer distributions of E. coli BW25113 TBDMS-derivatized proteinogenic amino acids (corrected)

表3 大腸桿菌突變株TBDMS衍生化的蛋白氨基酸的質(zhì)量同位體分布 (已校正)Table 3 Mass isotopomer distribution of E. coli BW25113 ΔiclR TBDMS-derivatized proteinogenic amino acids (corrected)

根據(jù)大腸桿菌原始菌和基因缺陷株的TBDMS衍生化的蛋白氨基酸的質(zhì)量同位體分布，可以計算得到2種菌株細(xì)胞中合成若干關(guān)鍵代謝物節(jié)點(diǎn)的代謝途徑的相對流量分布，也即代謝流比率 (圖1)。

由圖1可以看出，iclR基因敲除的大腸桿菌中丙酮酸由 ED 途徑得到的比率(f_Pyr_from_ED) 顯著增大、草酰乙酸由乙醛酸之路得到的上限顯著變大、磷酸烯醇丙酮酸由戊糖磷酸途徑得到的上限變小，而其他流比率變化不明顯。丙酮酸由蘋果酸得到的上下限均接近于零，說明在葡萄糖作為碳源的情況下，大腸桿菌原始菌和ΔiclR敲除菌中蘋果酸酶催化反應(yīng)的活性均極為低下。

圖1 大腸桿菌原始菌和ΔiclR突變株的代謝流比率Fig. 1 Flux ratios at several key metabolic nodes in E. coli BW25113 and E. coli BW25113 ΔiclR. a: f_PEP_ from_glycolysis; b: f_Pyr_from_ED; c: f_OAA_from_ PEP; d: f_PEP_from_OAA; e: f_Pyr_from_Mal_ub; f: f_Pyr_from_Mal_lb; g: f_OAA_from_glyoxylate_ub; h: f_PEP_from_PP_ub; lb: lower bound; ub: upper bound.

2.3 iclR基因敲除對菌體代謝流分布的影響

為了了解 iclR基因敲除對大腸桿菌整個中心代謝途徑的影響，可以基于所得到的代謝流比率結(jié)果、菌體的生理學(xué)參數(shù)以及細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)模型來計算整個中心代謝途徑中的凈反應(yīng)流量，并以此解析相關(guān)代謝反應(yīng)特性。

大腸桿菌原始菌和ΔiclR突變株的中心代謝流量分布情況如圖2所示。

圖2 原始菌和突變株的代謝流分布 (數(shù)值表示計算得到的凈流量，其值以葡萄糖比消耗速率 (單位以mmol/(g DCW·h)) 為基準(zhǔn))Fig. 2 Metabolic flux distribution of E. coli BW25113 and BW25113 ΔiclR. The numbers are net fluxes determined. The flux values are expressed relative to the specific glucose uptake rate as indicated in parentheses (in mmol/(g DCW·h)).

由圖2可以看出，iclR基因敲除大腸桿菌乙醛酸支路得到了激活，異檸檬酸分子有33%經(jīng)乙醛酸支路分解得到琥珀酸和乙醛酸，流經(jīng) TCA循環(huán)的流比率變小，糖酵解途徑流量比率變化不大，PP途徑流比率變小，而草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不變。

2.4 iclR基因敲除對菌體酶活性的影響

為了進(jìn)一步確認(rèn) iclR基因敲除大腸桿菌乙醛酸支路是否得到激活，測定了乙醛酸支路關(guān)鍵酶之一的異檸檬酸裂解酶的活性 (圖3)。由圖可以看出，iclR基因的敲除成功地解除了對異檸檬酸裂解酶表達(dá)的抑制作用，從而使該酶活得到了顯著提高，提高了60倍以上。

圖3 大腸桿菌原始菌和突變株中異檸檬酸裂解酶活性的比較Fig. 3 Comparison of enzyme activity of isocitrate lyase in E. coli BW25113 and BW25113 ΔiclR.

3 討論

為了闡明iclR基因敲除對大腸桿菌的影響，我們考察了糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、Entner-Doudoroff途徑、三羧酸循環(huán)、乙醛酸支路在內(nèi)的細(xì)胞中心代謝途徑中的代謝流量分布情況，并同時測定了乙醛酸支路關(guān)鍵酶之一的異檸檬酸裂解酶的活性。綜合以上得到的信息，為理解突變菌株的內(nèi)在代謝調(diào)控特點(diǎn)和規(guī)律提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

有報道稱乙醛酸支路的活性依賴于細(xì)菌的代謝狀態(tài)，在一些碳源條件下，如葡萄糖和丙酮酸條件下，乙醛酸支路是不激活的[25]。另外，有文獻(xiàn)報道通過酶活測定等方法得到：當(dāng) iclR 基因敲除時乙醛酸支路得到了激活[26-27]。然而，基于酶活性或代謝物分析等常規(guī)方法難以真正判斷細(xì)胞內(nèi)乙醛酸支路反應(yīng)的的活躍程度[18]。本研究通過基于穩(wěn)定同位素13C的代謝反應(yīng)流量分析并結(jié)合酶活性測定，系統(tǒng)地確定了大腸桿菌原始菌在葡萄糖上代謝時乙醛酸支路活性的缺乏，而iclR基因的敲除有效地激活了大腸桿菌的乙醛酸支路反應(yīng)，研究同時表明約有33%的異檸檬酸通過乙醛酸支路進(jìn)行代謝。

在我們得到上述研究結(jié)果的同時，Waegeman等[28]分別利用均勻13C標(biāo)記葡萄糖/天然葡萄糖 (20%∶80%，W∶W) 以及首位13C標(biāo)記葡萄糖/天然葡萄糖 (50%∶50%，W∶W) 的混合葡萄糖作為底物研究大腸桿菌 K12 MG1655 ΔiclRΔarcA菌株在葡萄糖豐富培養(yǎng)基上的代謝，同樣得到了乙醛酸支路被激活、30%異檸檬酸通過乙醛酸支路代謝，以及菌體得率得到很大提高等相似結(jié)論。

另有研究表明大腸桿菌在特定條件下會激活磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循環(huán)[29]。iclR基因敲除的大腸桿菌中，乙醛酸支路得到了激活，但研究表明草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶反應(yīng)流量基本不變，說明 iclR基因的敲除不會明顯影響未激活磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循環(huán)，碳原子沒有過多地通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反應(yīng)以 CO2形式排出而得以保留。乙醛酸支路的激活，異檸檬酸通過TCA循環(huán)的相對流量變小，以及PP途徑相對流量變小等使得CO2的釋放量減少，另外，突變株乙酸的得率亦變小，這些原因就使得iclR基因敲除菌的菌體得率有所變大。

iclR基因敲除菌的乙酸關(guān)于葡萄糖的得率減小。大腸桿菌中乙酸產(chǎn)生的原因一般是“溢出代謝”[30]的結(jié)果，是由于葡萄糖的攝取及細(xì)胞生物合成和能量需要之間的不平衡造成的[31-32]。大腸桿菌可以通過降低葡萄糖的利用速率或者促進(jìn)菌體的代謝來減少乙酸的產(chǎn)生[32]。突變株的葡萄糖比消耗速率較原始菌的小，另外，突變株乙醛酸支路的激活使得乙酰輔酶A的代謝效率更高，兩方面的原因使得ΔiclR突變株的乙酸得率略低于原始菌株。

本研究通過基于穩(wěn)定同位素13C的細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)流量定量解析，同時結(jié)合酶活檢測等初步分析了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)子在大腸桿菌細(xì)胞代謝中的作用。該研究提供的利用代謝流量比率作為限制條件的代謝反應(yīng)流量分析方法可以廣泛地應(yīng)用到更多的細(xì)胞體系和生物過程中，用以輔助對細(xì)胞特定基因功能以及代謝調(diào)控機(jī)理的闡明。

附錄1 大腸桿菌中心代謝網(wǎng)絡(luò)化學(xué)計量反應(yīng)式Appendix 1 The central metabolic network in Escherichia coli with the stoichiometric reactions

[1] Kornberg HL. The role and control of the glyoxylate cycle in Escherichia coli. Biochem J, 1966, 99(1): 1?11.

[2] Laporte DC, Stueland CS, Ikeda TP. Isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase. Biochimie, 1989, 71(9/10): 1051?1057.

[3] Bailey J. Toward a science of metabolic engineering. Science, 1991, 252(5013): 1668?1675.

[4] Stephanopoulos G. Metabolic fluxes and metabolic engineering. Metab Eng, 1999, 1(1): 1?11.

[5] Blank LM, Kuepfer L. Metabolic flux distributions: genetic information, computational predictions, and experimental validation. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86(5): 1243?1255.

[6] Zamboni N, Sauer U. Novel biological insights through metabolomics and13C-flux analysis. Curr Opin Microbiol, 2009, 12(5): 553?558.

[7] Niklas J, Schneider K, Heinzle E. Metabolic flux analysis in eukaryotes. Curr Opin Biotechnol, 2010, 21(1): 63?69.

[8] Heinemann M, Sauer U. Systems biology of microbial metabolism. Curr Opin Microbiol, 2010, 13(3): 337?343.

[9] Hua Q, Yang C, Baba T, et al. Responses of the central metabolism in Escherichia coli to phosphoglucose isomerase and glucose-6-phosphate dehydrogenase knockouts. J Bacteriol, 2003, 185(24): 7053?7067.

[10] Hua Q, Joyce AR, Fong SS, et al. Metabolic analysis of adaptive evolution for in silico-designed lactate-producing strains. Biotechnol Bioeng, 2006, 95(5): 992?1002.

[11] Hua Q, Yang C, Oshima T, et al. Analysis of gene expression in Escherichia coli in response to changes of growth-limiting nutrient in chemostat cultures. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(4): 2354?2366.

[12] Hua Q, Joyce AR, Palsson B?, et al. Metabolic characterization of Escherichia coli strains adapted to growth on lactate. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(14): 4639?4647.

[13] Yang C, Hua Q, Shimizu K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from13C-labeled glucose. Metab Eng, 2002, 4(3): 202?216.

[14] Blank LM, Kuepfer L, Sauer U. Large-scale13C-flux analysis reveals mechanistic principles of metabolic network robustness to null mutations in yeast. Genome Biol, 2005, 6(6): R49.

[15] McKinlay JB, Shachar-Hill Y, Zeikus JG, et al. Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NMR and GC-MS analyses of13C-labeled metabolic product isotopomers. Metab Eng, 2007, 9(2): 177?192.

[16] McKinlay JB, Vieille C.13C-metabolic flux analysis of Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism at different NaHCO3and H2concentrations. Metab Eng, 2008, 10(1): 55?68. [17] Szyperski T. Biosynthetically directed fractional13C-labeling of proteinogenic amino acids. An efficient analytical tool to investigate intermediary metabolism. Eur J Biochem, 1995, 232(2): 433?448.

[18] Hua Q, Yang C. Application of metabolic flux ratio analysis in metabolic engineering-a review. Chin J Biotech, 2009, 25(9): 1303?1311.花強(qiáng), 楊琛. 代謝流量比率分析及其在代謝工程中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(9): 1303?1311.

[19] Sauer U, Lasko DR, Fiaux J, et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J Bacteriol, 1999, 181(21): 6679?6688.

[20] Yang C, Hua Q, Shimizu K. Quantitative analysis of intracellular metabolic fluxes using GC-MS and two-dimensional NMR spectroscopy. J Biosci Bioeng, 2002, 93(1): 78?87.

[21] Dauner M, Sauer U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnol Prog, 2000, 16(4): 642?649.

[22] van Winden WA, Wittmann C, Heinzle E, et al. Correcting mass isotopomer distributions for naturally occurring isotopes. Biotechnol Bioeng, 2002, 80(4): 477?479.

[23] Fischer E, Sauer U. Metabolic flux profiling of Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS. Eur J Biochem, 2003, 270(5): 880?891.

[24] Fischer E, Zamboni N, Sauer U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived13C constraints. Anal Biochem, 2004, 325(2): 308?316.

[25] Molina-Henares AJ, Krell T, Eugenia Guazzaroni M, et al. Members of the IclR family of bacterial transcriptional regulators function as activators and/or repressors. FEMS Microbiol Rev, 2006, 30(2): 157?186.

[26] Maloy SR, Nunn WD. Genetic regulation of the glyoxylate shunt in Escherichia coli K12. J Bacteriol, 1982, 149(1): 173?180.

[27] Maloy SR, Bohlander M, Nunn WD. Elevated levels of glyoxylate shunt enzymes in Escherichia coli strains constitutive for fatty acid degradation. J Bacteriol, 1980, 143(2): 720?725.

[28] Waegeman H, Beauprez J, Moens H, et al. Effect of iclR and arcA knockouts on biomass formation and metabolic fluxes in Escherichia coli K12 and its implications on understanding the metabolism of Escherichia coli BL 21(DE 3). BMC Microbiol, 2011, 11(1): 70.

[29] Fischer E, Sauer U. A novel metabolic cycle catalyzes glucose oxidation and anaplerosis in hungry Escherichia coli. J Biol Chem, 2003, 278(47): 46446?46451.

[30] El-Mansi ENT, Holms WH. Control of carbon flux to acetate excretion during growth of Escherichia coli in batch and continuous cultures. Microbiology, 1989, 135(11): 2875?2883.

[31] Han K, Lim HC, Hong J. Acetic acid formation in Escherichia coli fermentation. Biotechnol Bioeng, 1992, 39(6): 663?671.

[32] Farmer WR, Liao JC. Reduction of aerobic acetate production by Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(8): 3205?3210.