分光光度法測(cè)定水體中葉綠素a含量的改進(jìn)

戴 欣 ，楊 航 ，石 巖 ，魯 雪 ，王玲靜 ，李 聰

（1.松遼流域水資源保護(hù)局松遼流域水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.河海大學(xué)，江蘇 南京 210098）

分光光度法測(cè)定水體中葉綠素a含量的改進(jìn)

戴 欣1，楊 航1，石 巖1，魯 雪1，王玲靜2，李 聰1

（1.松遼流域水資源保護(hù)局松遼流域水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.河海大學(xué)，江蘇 南京 210098）

本文在大量實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)分光光度法測(cè)定水體中葉綠素a方法進(jìn)行了改進(jìn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：過(guò)濾藻類使用玻璃纖維濾膜結(jié)果要優(yōu)于普通微孔濾膜;提取過(guò)程中用反復(fù)凍融法結(jié)果優(yōu)于研缽研磨法。

分光光度法；葉綠素a；改進(jìn)措施

0 引言

葉綠素a是浮游性藻類植物體內(nèi)重要化學(xué)成分，通過(guò)測(cè)定水體中藻類體內(nèi)葉綠素的含量可以推斷出水體中浮游植物的數(shù)量，進(jìn)而表征水體富營(yíng)養(yǎng)化的程度。

目前國(guó)內(nèi)測(cè)定葉綠素a的方法主要是使用分光光度法和熒光法，其中分光光度法較為常用。方法上主要采用SL88-1994[1]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，但該標(biāo)準(zhǔn)方法在實(shí)踐工作中還存在著實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行性不好、葉綠素a提取效率不高等問(wèn)題，因此，為了使測(cè)定葉綠素的標(biāo)準(zhǔn)方法更加完善，有必要對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)。

以下針對(duì)原方法中樣品保存、水樣處理等環(huán)節(jié)存在的問(wèn)題進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，提出了有效的改進(jìn)措施。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1）試劑。碳酸鎂懸濁液，ω（MgCO3）=1%；丙酮溶液，ρ（C3H6O）=90%(V/V)；鹽酸溶液，C(HCl)=0.1 mol/L。

2）儀器和設(shè)備?？梢?jiàn)分光光度計(jì)；抽濾器；微孔濾膜，直徑為47 mm、孔徑為0.7 μm的玻璃纖維濾膜；真空泵；低溫冰箱，能控制在-40℃±1℃；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速能達(dá)到3 000～4 000 r/min，宜使用帶控溫裝置的離心機(jī)。

3）水樣采集。根據(jù)不同的水體，采集500～1 000 ml水樣于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中，每升水樣加入1%的碳酸鎂懸濁液1 ml，以防止酸化引起的色素溶解。

4）樣品富集。將微孔濾膜放置在連接有真空泵的抽濾器上，根據(jù)水樣的富營(yíng)養(yǎng)化程度準(zhǔn)確量取定量體積的混勻水樣進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)負(fù)壓不應(yīng)超過(guò)20 kPa，逐漸減壓，在水樣剛剛完全通過(guò)濾膜時(shí)結(jié)束抽濾。用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對(duì)折，用濾紙吸干剩余水分。如樣品不能及時(shí)提取，應(yīng)將吸干水分的濾膜放入培養(yǎng)皿中，外面包裹一層鋁箔，放入-20℃以下的冰箱中保存。

5）提取。將過(guò)濾后的濾膜放入帶有螺帽的離心管中，旋緊螺帽，放入-40℃低溫冰箱中冷凍20 min，取出放置于室溫下5 min，此過(guò)程反復(fù)3次。向離心管中加入90%丙酮溶液10 ml，蓋緊旋帽劇烈搖振片刻，放置于4℃冰箱中避光浸泡4～12 h備用。

6）離心。將離心管放入離心機(jī)中，以3 500 r/min的速度離心15 min。

7）測(cè)定和計(jì)算。將離心后的上清液倒入1 cm比色皿中，以 90%丙酮溶液做參比，分別在 750，664，647，630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。帶入到計(jì)算公式中計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 過(guò)濾藻類的濾膜對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

SL88-1994標(biāo)準(zhǔn)方法使用的是一般微孔濾膜，多為醋酸纖維材質(zhì)。葉綠素a測(cè)定時(shí)要求750 nm處吸光度值低于0.005，因醋酸纖維濾膜在丙酮溶液中溶解，用一次離心方法有時(shí)很難達(dá)到分析要求。在實(shí)際測(cè)試中，使用醋酸纖維濾膜，樣品在750 nm處的吸光度為0.008～0.019，平均0.012。該方法參考美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)[2]使用玻璃纖維濾膜，雖然價(jià)格稍高，但可以有效地避免濾膜的溶解對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。在實(shí)際測(cè)試中，樣品750 nm處的吸光度值為0～0.005，平均為0.002，可以滿足750 nm處吸光度值低于0.005的要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不同提取方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

SL88-1994標(biāo)準(zhǔn)中使用研缽研磨濾膜。研缽是開放式的器皿，完全由實(shí)驗(yàn)人員手工操作，實(shí)驗(yàn)中使用的溶劑丙酮易揮發(fā)，對(duì)人體產(chǎn)生危害；另外研缽內(nèi)壁不平整，極易粘附濾膜殘?jiān)?，不易洗脫，易造成樣品損失；由于實(shí)驗(yàn)人員的差異，對(duì)研磨的操作不盡相同，容易引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差。

本方法中使用的反復(fù)凍融法[3]，即使用超低溫冰箱對(duì)濾膜上的藻類進(jìn)行反復(fù)冰凍-融化操作，使藻類細(xì)胞壁破裂，再使用丙酮進(jìn)行提取。反復(fù)凍融法不但具有易操作、葉綠素?fù)p耗少、溶劑揮發(fā)較少、操作平行性好、一次可處理大批樣品、勞動(dòng)強(qiáng)度少等優(yōu)點(diǎn)，還可以有效提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。

表1 使用不同材質(zhì)的微孔濾膜在750 nm處吸光度值對(duì)比

課題組在其他測(cè)定條件不變的情況下，分別使用研缽研磨和反復(fù)凍融法對(duì)兩組水樣中葉綠素a進(jìn)行了測(cè)定，可以看出，使用反復(fù)凍融法提取葉綠素a結(jié)果明顯優(yōu)于研缽的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2及圖1、圖2。

表2 使用不同提取方法提取葉綠素的檢測(cè)結(jié)果 μg/L

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法使用玻璃纖維濾膜能有效地減少濾膜溶解對(duì)樣品提取液的干擾，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確度水平；使用反復(fù)凍融法效地減少了操作步驟、保護(hù)了操作人員健康、同時(shí)可以處理大批樣品，同時(shí)還有效地提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。

［1］ SL88-1994，葉綠素的測(cè)定（分光光度法）［S］.

［2］EPA446.0,In Vitro Determination of Chlorophylls a,b,c1+c2 and Pheopigments in Marine And Freshwater Algae by Visible Spectrophotometry.

［3］張潔梅,張哲海.應(yīng)用凍融法測(cè)定湖泊水中葉綠素a含量［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，31(S2)：497—498.

X830.2

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2012-02-29