番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析及多重PCR快速檢測

薛東齊 李景富 許向陽 姜景彬

（東北農業(yè)大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）是世界上重要的蔬菜作物，品種多、營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高、用途廣泛。病毒病嚴重威脅著番茄的安全生產(chǎn)，其中番茄黃化曲葉病毒病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）發(fā)展迅速。TYLCD 首先在以色列發(fā)生（Czosnek & Laterrot，1997），而后蔓延到西班牙、意大利等地中海周邊國家（Wu et al.，2006），以及非洲、亞洲和澳洲（Tesoriero &Azzopardi，2006）的大部分國家和地區(qū)。19世紀90年代后期，TYLCD 首次由舊世界雙生病毒（Old WorldBegomoviruses）傳播到新世界雙生病毒（New WorldBegomoviruses），并在中美和北美嚴重危害番茄生產(chǎn)（Noris et al.，1994；Polston et al.，1999）。1998年我國廣西南寧首次發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒，經(jīng)分子生物學及血清學鑒定，該病毒為雙生病毒的一個新種——中國番茄黃化曲葉病毒（劉玉樂 等，1998）。近年來，我國浙江、福建、廣東、廣西、云南、江蘇、安徽、山東、河南、河北、山西、新疆等番茄主產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病，并造成巨大損失（李桂新 等，2003；徐幼平和周雪平，2006；何自福 等，2007；余文貴 等，2009；周瑩 等，2010）。

目前，不同地區(qū)的TYLCV 全序列已被大量報道（Fauquet et al.，2008），且都具有較高的相似性（Duffy et al.，2007；Owor et al.，2007），突變和基因重組是TYLCV 群體遺傳多樣性的根本動力（Sanz et al.，2000；Kitamura et al.，2004；Fauquet et al.，2005；Font et al.，2007；Owor et al.，2007）。筆者對TYLCV 中國分離物進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，以明確TYLCV 不同株系在我國的分布和傳播途徑。與此同時，通過基因多態(tài)性分析，針對TYLCV 的嚴格保守區(qū)設計出3 對引物，建立了以多重PCR 技術為基礎的快速、高效、特異性檢測TYLCV 的方法，從而降低了試驗成本，加速了試驗進程，可應用于工廠化育苗的帶毒性檢測、蔬菜大規(guī)模生產(chǎn)中植株發(fā)病情況的檢測及抗病育種，為蔬菜的安全可持續(xù)生產(chǎn)提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒樣品 2010年9月分別在上海、浙江、山東采集8份具有皺縮、褪綠、黃化、卷曲癥狀的番茄上部葉片，分別命名為SH-1，SH-2；ZJ-HZ，ZJ-JX，ZJ-NB；SD-SG，SD-WF，SD-LC。來自于GenBank 的41份去除冗余序列的TYLCV 分離物全基因組序列和1份WDV 分離物全序列見表1。

1.1.2 主要試劑 TPS 緩沖液；瓊脂糖凝膠 DNA 快速純化回收試劑盒（TaKaRa）；2xTaq MasterMix、RNase-Free Water（北京康為世紀生物科技有限公司）；pMD19-T Vector（TaKaRa）；氨芐青霉（Amp）；LB（Luria-Bertani）固體/液體培養(yǎng)基；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α為東北農業(yè)大學番茄課題組自備。

1.2 方法

1.2.1 番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析 DNA 序列相似性采用DNAMAN 6.0 軟件（Lynnon Biosoft，Quebec，Canada）進行處理和分析。多序列比對采用ClustalX2 軟件，系統(tǒng)進化樹的構建采用MEGA5 的鄰接法（Neighbor-joining）。DNA 序列核苷酸多態(tài)性分析采用DnaSP version 5軟件（Universitat de Barcelona，Spain）。多重PCR 引物采用Primer premier 6.0 設計，并由Oligo 7.0進行驗證，被用于比對和系統(tǒng)發(fā)育分析的TYLCV 分離物見表1。

1.2.2 多重PCR快速檢測方法的建立 取30 mm2的感病番茄葉片于1.5 mL 離心管中，吸取1 mL液氮于離心管中，并用1 mL 槍頭研磨葉片，加入150 μL TPS 緩沖液（100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，1 mol·L-1KCl，10 mmol·L-1EDTA）（Higgins et al.，2000），沸水浴10 min，冰上冷卻2 min，12 000 r·min-1、4℃離心5 min，上清液即可作為多重PCR 的模板。

參照表1中TYLCV 各分離物DNA-A 序列，根據(jù)其序列保守區(qū)，利用Primer Premier 6.0 設計3 對能完整克隆病毒CP、Rep、TrAP 3個片段的多重PCR 引物（表2），并通過Oligo 7.0 分別對這3 對引物與雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬中的其他60余種病毒進行驗證，設計出的3對引物均不能與菜豆金色花葉病毒屬中的其他病毒特異性匹配，因此較以往的只通過通用引物PA/PB 來驗證菜豆金色花葉病毒屬的TYLCV 具有較高的特異性，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 番茄黃化曲葉病毒GenBank 登錄號

表2 番茄黃化曲葉病毒多重PCR 引物

PCR 反應體系：10.9 μL RNase-Free Water，10.9 μL 2xTaq MasterMix，上下游引物各0.5 μL，基因組DNA 0.2 μL。充分混勻后于PCR（Bio-Rad，USA）儀上進行擴增。擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應完畢后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物切膠后用TaKaRa 公司的瓊脂糖凝膠DNA 快速純化回收試劑盒進行DNA 回收純化。

PCR 回收產(chǎn)物被克隆進pMD19-T Vector，連接轉化感受態(tài)大腸桿菌，涂布在具氨芐青霉素（Amp）抗性的LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基（Amp 濃度為50 μg·mL-1）平板上，37℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落于Amp 濃度為50 μg·mL-1的LB 液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜。提取質粒進行PCR 陽性鑒定后測序，測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 田間感病番茄植株癥狀表現(xiàn)

樣品采集地田間感病番茄植株癥狀與番茄黃化曲葉病毒病的典型癥狀極為相似，即表現(xiàn)為：植株中上部葉片葉緣黃化、上卷，葉片變小、變厚，植株生長變緩或停滯，節(jié)間縮短并明顯矮化；植株下部葉片稍卷曲、黃化，并出現(xiàn)黃綠不均勻斑塊；后期果實小而少、畸形、成熟慢，產(chǎn)量和品質嚴重下降。

2.2 番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 番茄黃化曲葉病毒在我國的區(qū)域分布及系統(tǒng)發(fā)育分析 TYLCV 在自然條件下只能由煙粉虱傳播，近年來在我國許多地區(qū)Q型煙粉虱已完全取代了B型煙粉虱，成為番茄黃化曲葉病毒病的主要傳毒介體，且B型和Q型煙粉虱在入侵過程中沒有明顯的瓶頸效應，不同種群間存在著顯著的遺傳分化和基因交流（龔一帆 等，2009）。李剛等（2010）對番茄大棚定植初期番茄黃化曲葉病毒病病株和棚內煙粉虱進行了抽樣調查，結果表明番茄黃化曲葉病毒病病株和煙粉虱在空間分布型上一致，均呈聚集分布。傳毒特性研究發(fā)現(xiàn)，低密度的帶毒煙粉虱即可導致TYLCV的暴發(fā)流行。因此，雖然世界各地的番茄黃化曲葉病毒名稱一樣，但病毒的基因組成相差很大。根據(jù)國際病毒分類委員會規(guī)定，雙生病毒科病毒全基因組核苷酸序列相似性小于89%則被定名為不同病毒，大于89%則被認為是同一病毒的不同株系（Deng et al.，1994）。對表1中的TYLCV全序列采用MEGA5 的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)進化樹（自舉值為1 000）（圖1）。

從圖1可知，在我國番茄主產(chǎn)區(qū)均已發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒，且主要為2種病毒所侵染，一種為番茄黃化曲葉中國病毒（TYLCCNV）及其株系，侵染省份主要為我國西南部和西部的廣西、云南、四川、新疆等地，其與番茄黃化曲葉泰國病毒（TYLCTHV）具有78.20%～83.49%的相似性，并與歐洲的TYLCMalV 和TYLCSV 也具有較遠的親緣關系，說明TYLCCNV 是一個單獨的進化分支（Cluster Ⅱ）（劉玉樂 等，1998）；另一種為番茄黃化曲葉以色列病毒（TYLCV-IL）及其株系，侵染省份主要為我國中東部和東南沿海地區(qū)的河北、河南、安徽、山東、江蘇、浙江、上海等地，主要分為兩大分支，浙江、山東等地與日本的Haruno株系形成一個分支，并與其具有99.64%的相似性，江蘇、北京的分離物與日本的Tomigusuku株系、美國的California株系、墨西哥的Culiacan株系和Sinaloa株系形成一個分支（Cluster Ⅳ），并具有98.56%～99.17%的相似性，說明侵染我國的TYLCV-IL 很有可能來源于日本和中北美洲西部沿海地區(qū)。

圖1 基于DNA-A 全序列構建的番茄黃化曲葉病毒分子進化樹

2.2.2 番茄黃化曲葉病毒CP基因序列測定和相似性分析 對圖2、3 中的CP 核苷酸和氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)圖2、3 中的ClusterⅢ分支均獨立于其余各分支，且與各分支間具有72.76%～73.41%的相似性；而其余各分支間具有較近的親緣關系，相似性均在97.04%以上，這也進一步證明了圖1所揭示的結果，即侵染我國番茄主產(chǎn)區(qū)的TYLCV 主要分為兩大群，一為TYLCV-IL及其株系，二為TYLCCNV 及其株系。本試驗所測定的8個CP 序列均與TYLCV 以色列病毒具有97.56%（核苷酸）/98.27%（氨基酸）以上的相似性。由于在CP基因上發(fā)生的任何遺傳突變，只要影響到病毒的包裝、病毒粒體的結構及穩(wěn)定性，或是病毒粒體表面結構，均可造成傳毒能力的喪失或傳毒效率的降低，而CP相對比較保守，且可作為病毒顆粒結構蛋白，由此可知這8個樣品也屬于TYLCV 以色列病毒。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CP N 端的134、152位的氨基酸殘基發(fā)生突變，突變體能侵染但不能被煙粉虱傳播（Noris et al.，1998）。由此可見，CP的穩(wěn)定性是保證TYLCV能夠侵染和流行的關鍵因素。山東、浙江、上海地區(qū)分離物的CP具有極高的相似性，說明同一年度不同的省份內有相同的株系暴發(fā)流行，這可能與煙粉虱極強的遷飛性有關。同時，3 省份暴發(fā)流行的TYLCV 也可能是由單基因型造成的多個傳播鏈引起的，且無明顯的時間和地理分布傾向。說明不同省份有多個不同TYLCV 基因型引起的持續(xù)傳播，同時不同省份也存在相同病毒的傳播鏈。

圖2 49份番茄黃化曲葉病毒核苷酸序列相似性比較結果

2.3 番茄黃化曲葉病毒的基因多態(tài)性分析

圖3 49份番茄黃化曲葉病毒CP 氨基酸序列相似性結果

通過對表1中的核苷酸全序列比對，表明TYLCV 各分離物具有96.0%～99.7%的相似性。為了評估TYLCV 各分離物核苷酸序列突變的程度，采用DnaSP V5 軟件對核苷酸序列多態(tài)性進行分析。通過統(tǒng)計33個分離物各基因組每個核苷酸位點的突變頻率，得到病毒核苷酸序列各位點的突變指數(shù)分布（圖4）。多態(tài)性最高區(qū)域為IR 區(qū)；與此同時還存在另外2個多態(tài)性較高的區(qū)域，一個在AV1ORF 內，另一個在AC2與AC3的ORF 重疊區(qū)域內；最保守區(qū)域在AV1與AV2的ORF 重疊區(qū)；另外2個次級保守區(qū)分別是AV1與AC3的ORF 重疊區(qū)、AC2與AC3的部分ORF 重疊區(qū)。

由TYLCV 的系統(tǒng)發(fā)育分析可知，除云南、廣西、四川、新疆等地占主導地位的是TYLCCNV 外，我國其他地區(qū)的病毒分離物均與世界范圍流行的TYLCV-IL 有較高的相似性（Zubiaur et al.，1996；Navas-Castillo et al.，1999；Duffy et al.，2007），說明TYLCV 在進化上具有較強的保守性，而且核苷酸突變位點在染色體上的分布具有不穩(wěn)定性。

圖4 番茄黃化曲葉病毒的核苷酸序列多態(tài)性（Pi）分析結果

2.4 番茄黃化曲葉病毒的多重PCR檢測

利用表2中的3 對引物對樣品進行多重PCR 擴增，1.2%瓊脂糖電泳檢測，8個樣品均擴增出大小約400、780、1 100 bp 的特異性條帶（圖5）。對780 bp 左右的特異性條帶（CP條帶）進行回收，克隆進pMD19-T 載體，測序后提交到GenBank（JQ768337-JQ768344）。核苷酸和氨基酸序列相似性檢驗結果顯示，8個樣品均與北京、江蘇等地的TYLCV 分離物具有較近的親緣關系。

圖5 番茄黃化曲葉病毒的多重PCR檢測結果

3 結論與討論

近年來由TYLCV 引起的番茄黃化曲葉病毒病已成為世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的重要限制因素，以往都是發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)，而今卻在溫帶地區(qū)的中國大面積發(fā)生，且主要為TYLCV-IL和TYLCCNV 各分離物所侵染，并已逐步形成由南向北、由沿海向內陸蔓延的格局。從發(fā)病蔓延趨勢來看，該病由點、片發(fā)生向面式暴發(fā)遞進，并已經(jīng)蔓延到國內各大番茄主產(chǎn)區(qū)，對番茄生產(chǎn)造成了嚴重危害。造成該病在我國大面積暴發(fā)的原因有：① 全球氣候變暖，使得B型、Q型煙粉虱能夠在北方越冬；② 溫室、大棚等保護地設施的大規(guī)模使用，也使得B型、Q型煙粉虱成為春茬栽培番茄的病毒侵染源；③ 番茄主產(chǎn)區(qū)栽培品種的單一化也為黃化曲葉病毒的爆發(fā)創(chuàng)造了有利條件（Zhang et al.，2009）。常用的檢測番茄黃化曲葉病毒的方法有PCR檢測法和ELISA 檢測法，由于TYLCV 主要存在于寄主植物的韌皮組織，且其濃度較低，因此應用ELISA檢測感病植株體內的TYLCV 需要較好質量的抗血清。本試驗建立的DNA 快速提取方法較SDS法（Guillemaut & Marechal-Drouard，1992）、快速一步法（ROSE）（方宣鈞 等，1997）、改良CTAB法（陳紹寧和崔繼哲，2004）而言，步驟簡單、方便，可在短時間內完成大量樣品的DNA 制備。與此同時，根據(jù)TYLCV 的全序列設計出3 對特異性引物，建立了快速、準確的TYLCV 檢測體系，可應用于工廠化育苗的帶毒性檢測、蔬菜大規(guī)模生產(chǎn)中植株發(fā)病情況的檢測及抗病育種，為蔬菜的安全可持續(xù)生產(chǎn)提供有力支撐。

本試驗中，從病毒DNA-A 序列多態(tài)性分布可知IR 區(qū)、AC2區(qū)、AC3區(qū)均具有較高的多態(tài)性。其中AC2編碼轉錄激活蛋白（TrAP），其突變可能增加該蛋白的活性，并促進DNA-A 鏈晚期基因AV1的轉錄，從而翻譯出大量病毒外殼蛋白。AC3基因編碼復制增強蛋白（REn）能夠大大增加病毒DNA 在體內的復制，從而導致病毒顆粒大量累積，造成嚴重的系統(tǒng)性侵染。AC1具有較高的保守性，這也進一步驗證了其編碼的復制相關蛋白（Rep）是病毒DNA 復制的唯一病毒蛋白，而AC1和AC2編碼區(qū)的突變則妨礙病毒的侵染。

從CP 核苷酸和氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析中不難看出，核苷酸序列的相似性和氨基酸序列的相似性基本上是一致的，核苷酸的突變可能并不導致氨基酸的變異，不會影響蛋白質的結構和功能，但少數(shù)位點的核苷酸突變可能會引起氨基酸的較大變異。雖然在我國中東部番茄主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)流行的是TYLCV 以色列株系，其彼此間的遺傳距離較小，但隨著時間的推移，TYLCV 局部地區(qū)優(yōu)勢株系易與雙生病毒科其他種之間發(fā)生基因重組，產(chǎn)生新的病毒或者株系，新病毒或株系與原來的病毒復合侵染極易引起病害的大流行。因此，應監(jiān)測不同國家，甚至是同一國家不同地區(qū)所暴發(fā)流行的TYLCV株系分布和病毒分子特征，來確定病毒的來源和傳播路徑，提供TYLCV 的防治策略，科學的阻斷其傳播。

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