外源NO和H2O2誘導(dǎo)不同顏色馬鈴薯花青素積累

馬廷蕊 張金文* 梁慧光* 柳永強(qiáng)

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；3 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州 730070）

花青素（anthocyanin）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的水溶性天然色素，屬類黃酮化合物。自然狀態(tài)下花青素常與各種單糖形成花色苷，因吸光性差異而表現(xiàn)出紅、紫和藍(lán)等色彩，其具有抗氧化、抗突變、抗增生等多種生理功能（侯夫云 等，2009；Ma et al.，2012）。NO 作為植物抗逆脅迫和一些生理生化代謝的重要信號分子，在植物次生代謝啟動、通過ROS 反應(yīng)參與植物抗性調(diào)控功能方面有重要作用（徐茂軍，2007）。H2O2是植物細(xì)胞應(yīng)答逆境產(chǎn)生的重要信號分子，植物通過H2O2過量產(chǎn)生調(diào)控一系列脅迫應(yīng)答和次生代謝合成（李師翁 等，2007），大量研究表明，NO 或H2O2對植物遇到干旱、高溫、低溫、病害和鹽堿等逆境時(shí)所產(chǎn)生的很多內(nèi)源物質(zhì)有調(diào)控作用。近年來研究表明，NO 或H2O2誘導(dǎo)植物次生代謝可以產(chǎn)生紫杉醇（徐茂軍 等，2004；徐茂軍和董菊芳，2006）、葛根素（徐茂軍 等，2006）、金絲桃素（徐茂軍 等，2008），而關(guān)于其在植物花色素代謝方面的研究很少。本試驗(yàn)采用SNP、H2O2、SNP+ H2O2處理不同塊莖顏色的馬鈴薯（Solanum tuberosumL.），研究其對馬鈴薯花色素積累及相關(guān)酶類的調(diào)節(jié)，旨在探索NO 和H2O2誘導(dǎo)馬鈴薯花色素合成反應(yīng)及調(diào)節(jié)的機(jī)理，為鮮食保健馬鈴薯品種的選育，馬鈴薯花青素代謝與調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種隴薯8 號（L8）、隴薯7號（L7）和LC310-2（LC）由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供，山東彩肉（SD）從山東省泰安市農(nóng)業(yè)局引進(jìn)。其品種特性與主要干物質(zhì)含量見表1 和圖1。

1.2 試驗(yàn)方法

2010年10月中旬采收脫毒微型種薯，3～5 ℃冷藏至2011年4月中旬，試驗(yàn)前取出，選擇直徑1.5～2.2 cm 的種薯，噴灑40%氯乙醇液催芽6 d（芽長約0.15 cm），置于濕棉布上攤開，在散射光下煉芽7 d，待芽粗壯后整薯盆栽于秦王川試驗(yàn)溫室（張和鳴和韓淑蕙，1959；Liu et al.，2011）?，F(xiàn)蕾期開始用清水、0.1 mmol·L-1SNP（NO 供體）、0.25 mmol·L-1H2O2、0.1 mmol·L-1SNP+0.25 mmol·L-1H2O2進(jìn)行處理，每隔7 d 處理1 次，每處理5 株，3 次重復(fù)。取樣時(shí)間按照各品種生育期依次進(jìn)行，LC 和SD 播種70 d 后取樣測定各指標(biāo)，15 d 后L7 和L8 取樣。

表1 供試馬鈴薯品種特性和塊莖主要干物質(zhì)含量

圖1 供試馬鈴薯塊莖顏色

1.3 測定項(xiàng)目

1.3.1 花青素含量測定 馬鈴薯塊莖去皮后，分別稱取薯皮和薯肉薄片2.5 g，室溫條件下加石英砂研磨成勻漿，室溫下用1%鹽酸-甲醇溶液提取，將粗提液暗置24 h，10 000 g 離心5 min，取上清液，測其在530、620 和650 nm 下的吸光值，花青素吸光值按OD530-0.9×OD620-0.1×OD650計(jì)算（廉玉姬 等，2009）。

1.3.2 苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性測定 馬鈴薯塊莖去皮后，分別稱取薯皮和薯肉薄片5 g，加5 mmol·L-1巰基乙醇硼酸緩沖液10 mL、0.5 g PVP，冰浴研磨，勻漿抽氣過濾，4 ℃ 10 000 g離心15 min，取上清液1 mL，加0.02 mol·L-1苯丙氨酸1 mL、蒸餾水2 mL；對照為上清液1 mL加入蒸餾水3 mL。30 ℃恒溫浴熱0.5 h，測其在290 nm 下的吸光值（Liu et al.，2011）。

1.3.3 多酚氧化酶（PPO）活性測定 馬鈴薯塊莖去皮后，分別稱取薯皮和薯肉薄片0.5 g，加0.05 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 5.5）5 mL，冰浴研磨后加入0.1 mol·L-1鄰苯二酚1 mL，混勻后35 ℃恒溫浴熱15 min，測其在325 nm 下的吸光值（Liu et al.，2011）。

1.3.4 查爾酮異構(gòu)酶（CHI）活性測定 馬鈴薯塊莖去皮后，分別稱取薯皮和薯肉薄片0.5 g，加5 mL 巰基乙醇緩沖液，其中0.05 mol·L-1Na2HPO4（pH 7.0）3 mL、0.05 mol·L-1抗壞血酸0.5 mL、0.018 mol·L-1巰基乙醇1.5 mL，冰浴研磨勻漿，4 ℃ 15 000 g 離心20 min，取上清液1 mL，加0.02 mol·L-1苯丙氨酸1 mL、蒸餾水2 mL；對照為上清液1 mL 加入蒸餾水3 mL。30 ℃恒溫浴熱0.5 h，測其在290 nm 下的吸光值（Lister & Lancaster，1996）。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件和Excel 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP 和H2O2處理對不同顏色馬鈴薯塊莖花青素含量的影響

由圖2 可知，對于不同塊莖顏色的馬鈴薯，其花青素含量表現(xiàn)為LC﹥SD﹥L7﹥L8，并且SNP 和H2O2處理誘導(dǎo)了馬鈴薯塊莖花青素含量的升高，其效果表現(xiàn)為0.1 mmol·L-1SNP+0.25 mmol·L-1H2O2＞0.25 mmol·L-1H2O2＞0.1 mmol·L-1SNP＞清水（CK）。0.1 mmol·L-1SNP 處理分別使L8、L7、LC 和SD 薯皮花青素含量增加2.13%、3.78%、9.71%、0.47%；H2O2處理分別使L8、L7、LC 和SD 薯皮花青素含量增加5.51%、11.34%、15.77%、18.79%，薯肉花青素含量增加4.91%、13.09%、9.82%、11.57%；SNP+H2O2處理分別使L8、L7、LC 和SD 薯皮花青素含量增加15.75%、13.60%、16.43%、27.77%，薯肉花青素含量增加11.96%、10.37%、25.06%、13.70%。說明NO 和H2O2對馬鈴薯塊莖花青素的合成具有促進(jìn)作用，且兩者均表現(xiàn)為加性效應(yīng)。

圖2 SNP 和H2O2處理對不同顏色馬鈴薯塊莖花青素含量的影響

2.2 SNP 和H2O2處理對不同顏色馬鈴薯塊莖PAL、CHI、PPO活性的影響

由表2 可知，不同顏色馬鈴薯（薯皮和薯肉）PAL 和CHI 活性LC＞SD＞L7＞L8，且SNP和H2O2處理使PAL 和CHI 活性呈升高趨勢，其作用效果表現(xiàn)為0.1 mmol·L-1SNP+0.25 mmol·L-1H2O2＞0.25 mmol·L-1H2O2＞0.1 mmol·L-1SNP＞清水（CK）的趨勢。表明NO 和H2O2可以促使馬鈴薯塊莖PAL 和CHI 活性升高，且兩者呈加性效應(yīng)。

不同顏色的馬鈴薯（薯皮和薯肉）PPO 活性為SD＞LC＞L7＞L8，并且SNP 和H2O2處理使馬鈴薯塊莖PPO 活性升高；除L8 外，其作用效果為0.1 mmol·L-1SNP +0.25 mmol·L-1H2O2＞0.25 mmol·L-1H2O2＞0.1 mmol·L-1SNP＞清水（CK）。同樣，NO 和H2O2處理對馬鈴薯塊莖PPO活性的增加具有一定的促進(jìn)作用，且表現(xiàn)為加性效應(yīng)。

表2 SNP 和H2O2處理對不同顏色馬鈴薯塊莖PAL、PPO 和CHI 活性的影響 FW

3 結(jié)論與討論

在植物次生代謝過程中，很多植物信號物質(zhì)如MeJa、SA、GA、ABA 和腐胺等對其花色素代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。GA 通過誘導(dǎo)CHS、CHF、DFR和ANS基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素苷合成（Ju et al.，1995；田義 等，2009）。作為植物信號分子的NO 和H2O2，在植物體復(fù)雜的次生代謝通路中，通過NOS 依賴途徑或相關(guān)酶類的激活和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)植物的各種次生代謝進(jìn)程（徐茂軍，2007）。ROS 信號途徑作用于NO 的下游并介導(dǎo)NO 誘發(fā)植物次生代謝產(chǎn)物合成，但是在不同植物細(xì)胞中，NO 對其下游的ROS 等信號途徑的調(diào)控作用并不完全相同。煙草細(xì)胞中PAL活化的誘發(fā)作用可以被H2O2淬滅劑CAT 抑制，說明H2O2是煙草等植物細(xì)胞中PAL 活化所必需的信號分子，而PAL 活性是植物合成花青素等次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶類；同樣，研究證明H2O2是介導(dǎo)橘青霉細(xì)胞壁誘導(dǎo)子誘發(fā)紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇生物合成所必需的信號分子（徐茂軍 等，2004；徐茂軍和董菊芳，2006）。以上研究說明，NO 通過NOS 依賴途徑誘導(dǎo)植物次生代謝的發(fā)生；而H2O2不僅作為NOS 的成員介導(dǎo)了NO 信號的傳遞，也通過PAL 活性啟動調(diào)節(jié)花青素等次生代謝產(chǎn)物的合成。本試驗(yàn)中，NO 和H2O2均能促進(jìn)馬鈴薯薯皮和薯肉花青素合成，H2O2對花青素合成具有較高的作用效果，且兩者存在加性效應(yīng)。一方面可能因?yàn)椋琀2O2對花青素合成有更為直接的促進(jìn)作用，而NO 可能在NOS（H2O2）上游，通過NOS 反應(yīng)間接調(diào)控了馬鈴薯花青素的合成，這種解釋進(jìn)一步證明了NO 通過NOS 依賴途徑誘導(dǎo)植物次生代謝（徐茂軍，2007）的說法的合理性；也可能因?yàn)?，在花青素代謝調(diào)節(jié)中，NO 和H2O2作為兩種獨(dú)立的信號途徑參與了其代謝調(diào)節(jié)，只是H2O2相對NO 具有更好的作用效果。

本試驗(yàn)是在大田栽培條件下，用外源SNP 和H2O2溶液處理馬鈴薯，在終花期測定馬鈴薯薯皮和薯肉花青素積累量及相關(guān)酶活性，闡述了NO 和H2O2對馬鈴薯花青素積累的誘導(dǎo)作用，但NO 和H2O2是通過何種方式誘導(dǎo)馬鈴薯花青素的合成及其信號傳遞還有待進(jìn)一步深入研究。

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