菜豆（油豆角）炭疽病菌的分離鑒定及抗病資源篩選

張 婷 胡國富，* 肖子恒 李鶴春 詹 云

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，黑龍江哈爾濱 150069）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）是豆科菜豆屬中的栽培種，油豆角是我國東北地區(qū)特有的一個優(yōu)質(zhì)軟莢菜豆變異類型，其營養(yǎng)豐富，食用品質(zhì)高（菜豆種質(zhì)資源主要性狀鑒定子專題組，1992a）。由于油豆角的生長對地理環(huán)境及氣候條件要求較嚴，一些品質(zhì)極佳的油豆角只適于在黑龍江及吉林、內(nèi)蒙古東北等冷涼地區(qū)生長（修殿權(quán) 等，2009）。炭疽病是嚴重為害油豆角商品價值和食用價值的真菌病害之一（王曉鳴 等，1989），已成為影響油豆角產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的重大障礙。關(guān)于黑龍江地區(qū)油豆角的炭疽病已有了初步的研究，張冬等（2007）對油豆角炭疽病病原菌的形態(tài)特征進行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在油豆角葉片及豆莢病斑的中部有炭疽菌的分生孢子盤，并且通過組織分離法，分離得到了炭疽病的病原菌——膠孢炭疽菌。馮國軍（2008）利用SSR 標記和聚類分析完成了對黑龍江油豆角豆莢的分類。菜豆種質(zhì)資源主要性狀鑒定子專題組（1992b）對莢用菜豆品種資源炭疽病苗期抗病性鑒定的研究表明，全國莢用菜豆抗炭疽病品種資源在地區(qū)分布上以黑龍江省和吉林省地方品種資源中的抗病材料最多。黑龍江地區(qū)油豆角抗炭疽病資源的篩選、鑒定和積累，對于油豆角的育種以及提高油豆角產(chǎn)量和品質(zhì)都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病原菌采集于香坊農(nóng)場油豆角病莢；供試油豆角材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院提供，共計48 份，品種名稱和來源見表1。2010年5～7月，試驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物實驗室進行。

表1 供試油豆角品種名稱及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和鑒定

①病原菌的分離純化和形態(tài)鑒定 在香坊農(nóng)場試驗地采集具有炭疽病癥狀的新鮮病莢，采用方中達（1979）的常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離，采用稀釋純化法對培養(yǎng)物進行純化。將分離物的孢子加適量滅菌水制成孢子懸浮液，稀釋到每一小滴懸浮液中大致只有1 個孢子。鏡檢證實后，移至PDA 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d 和7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，3 次重復(fù)。7 d 后觀察記錄菌落生長特征。利用科赫法則進行驗證。

②分子鑒定 將菌株接種到PDA 平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d。采用改良的CTAB 法（Kim，1997）提取基因組DNA。

根據(jù)油豆角炭疽病菌GenBank（登錄號為AB087222）長度為480 bp 的序列Colletotrichum linde-muthianumgenes for ITS1，5.8S rRNA，ITS2（Moriwaki，2002），用primer 5.0 軟件設(shè)計一對特異引物TJB1F：5′ ACGCTCTATAACCCTTTGTGA 3′，TJB1R：5′ CGGTGCGAGGTGGTATGT 3′。

PCR 擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

使用?；鵇NA 凝膠回收試劑盒（哈爾濱?；锟萍加邢薰荆U增產(chǎn)物進行膠回收后，與大腸桿菌感受態(tài)連接，轉(zhuǎn)化，得到質(zhì)粒DNA。然后對質(zhì)粒DNA 進行單、雙酶切檢測，通過酶切檢測的新鮮菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，并對測序結(jié)果進行BLAST 比對。

1.2.2 抗病資源的篩選

①苗期葉部抗病性鑒定 將供試油豆角種子經(jīng)3%次氯酸鈉溶液消毒5 min 后，用無菌水沖洗2 次，放到鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃催芽。待胚根長出時，將其播種于裝有滅菌土的塑料缽中，放置在25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)育苗，每個品種重復(fù)3 次，每重復(fù)5缽苗（每缽3 株）。

采用馮國軍（2008）的方法分離鑒定出菜豆炭疽菌，將其接種于滅過菌的PDA 培養(yǎng)基上，放于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14 d。將長好的菌落制成孢子懸浮液（孢子懸浮液濃度為5×105個·mL-1）。采用李錫香和王素（2006）的噴霧接種法進行接種。

參照《糧食作物種質(zhì)資源抗病蟲鑒定方法》（吳全安，1991），菜豆炭疽菌接種7 d 后調(diào)查單株發(fā)病等級，以《普通菜豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》（王述民 等，2006）為標準進行抗性水平的評價。

②成熟期莢部抗病性鑒定 在香坊農(nóng)場種植供試油豆角品種，每個品種20 株，每株取5個莢，豆莢的規(guī)格以達到商品收獲期為準。菌液制備與濃度測定同苗期，根據(jù)李永鎬等（1992）的方法進行接種。將菌液（孢子濃度為106～107個·mL-1）用小型噴霧器均勻噴灑到豆莢上，直到豆莢上布滿小水珠又不流下為止。接種后，將裝有豆莢的培養(yǎng)皿用氣密性好、透光性強的塑料袋裝好，置于25 ℃的恒溫箱內(nèi)。黑暗培養(yǎng)48 h，接著16 h 光照/8 h 黑暗交替培養(yǎng)。每個品種3 次重復(fù)。接種10 d 后，調(diào)查發(fā)病情況，方法同苗期。

③不同部位抗性相關(guān)分析 用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件對苗期葉部的病情指數(shù)與成熟期莢部的病情指數(shù)進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

油豆角炭疽病葉部發(fā)病癥狀如圖1。

經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定得到的菜豆炭疽菌，其生物學(xué)形態(tài)如圖2。在PDA 培養(yǎng)基上，4 d 后菌落平均直徑1.4 cm，7 d 后菌落平均直徑2.9 cm。菌落平坦，邊緣整齊，正面白色，背面桔黃色；灰白色菌絲絨毛狀；正面和背面均可見同心輪紋，10 d 后同心輪紋上生出直徑0.5～2.0 mm 的黑色顆粒。在菜豆汁瓊脂培養(yǎng)基上，病原菌生長緩慢，4 d 后菌落平均直徑1.3 cm，7 d 后菌落平均直徑2.5 cm。菌落平坦，邊緣整齊，正面灰褐色，背面桔黃色；灰褐色菌絲絨毛狀，比PDA 培養(yǎng)基上厚；無同心輪紋。

圖1 油豆角炭疽病葉部發(fā)病癥狀

分生孢子盤大小不定，偶生黑色剛毛（圖3-a）。分生孢子梗有分支。分生孢子長卵形、圓柱形，兩端鈍圓或一段稍狹，無色，單胞，正直或微彎，（8.0～15.0）μm×（3.5～6.0）μm，內(nèi)含顆粒狀物（圖3-b、3-c）。附著胞較小（圖3-d）。病菌在菜豆汁瓊脂培養(yǎng)基上比PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢多。經(jīng)科赫法則驗證，從侵染病斑上重新分離的病原菌菌落特征和原分離菌株相同。

圖2 菜豆炭疽菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落特征

圖3 菜豆炭疽菌孢子的顯微形態(tài)

2.2 分子鑒定

經(jīng)過特異引物擴增，得到一個422 bp 的基因片段（圖4）。經(jīng)過膠回收、菌落PCR 后，進行質(zhì)粒提取和單雙酶切（圖5）后測序，經(jīng)BLAST 比對，和菜豆炭疽菌（Colletotrichum lin-demuthianum）（序列號：AB087222.1）的相關(guān)序列有100%的同源性，支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

圖4 菜豆炭疽菌特異引物的PCR 擴增結(jié)果

圖5 質(zhì)粒提取和酶切鑒定

2.3 苗期葉部抗病性鑒定

葉部接種7 d 后調(diào)查單株發(fā)病等級，各品種發(fā)病程度不同。從表2 可以看出，在被測的48 份材料中，高抗材料有4 份，占總數(shù)的8%，分別是九月油、大油豆、綠豐架油豆、中華油豆；抗病材料有8 份，占總數(shù)的17%；中抗材料有32 份，占總數(shù)的67%；感病材料有3 份，占總數(shù)的6%，分別是翻白眼、分枝將軍、黃金溝；高感材料有1 份，占總數(shù)的2%，是花生米油豆。

表2 不同油豆角品種幼苗葉部抗炭疽病鑒定結(jié)果

2.4 成熟期莢部抗病性鑒定

豆莢接種10 d 后調(diào)查發(fā)病情況，從表3可以看出，在被測的48 份材料中，沒有高抗材料；抗性材料有11 份，占總數(shù)的23%；中抗材料有28 份，占總數(shù)的58%；感病材料有4 份，占總數(shù)的8%，分別是花生米油豆、玻璃脆豆、一棵樹、黃金溝；高感材料有5 份，占總數(shù)的10%，分別為新超抗架豆王、大油豆、吉科油豆、地圖豆、翻白眼。

2.5 油豆角植株不同部位抗性相關(guān)分析

用SPSS 軟件以苗期葉部的病情指數(shù)和成熟期莢部的病情指數(shù)為變量對不同部位抗性進行相關(guān)分析。在被測的48 份材料中，葉抗病性與莢抗病性具有相關(guān)性，Kendall 相關(guān)系數(shù)為0.315，Spearman 相關(guān)系數(shù)為0.411（表4）。表明油豆角葉抗病性與莢抗病性呈極顯著相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

表3 不同油豆角品種莢部抗炭疽病鑒定結(jié)果

表4 不同部位抗性相關(guān)分析

張冬等（2007）認為引起黑龍江省菜豆炭疽病的病原菌是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。本試驗中得到的致病菌經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子鑒定為菜豆炭疽菌。膠孢炭疽菌和菜豆炭疽菌同為炭疽菌屬，從形態(tài)上看，只有分生孢子的大小不同，因此極難區(qū)別，必須要通過分子生物學(xué)手段進一步鑒定。膠孢炭疽菌的寄主廣泛，包括豆科植物，因此其侵染油豆角也是極有可能的。由于取樣地和取樣品種的不同，結(jié)果很可能不同。要想弄清黑龍江省油豆角炭疽病的病原菌到底是菜豆炭疽菌還是膠孢炭疽菌，或者是二者都有，還需要加大取樣范圍和樣本數(shù)量，進一步鑒定。馮國軍等（2008）和古瑜等（2011）在關(guān)于菜豆種質(zhì)資源對炭疽病的抗性鑒定中，只是對苗期的抗性進行了鑒定，并沒有對莢的抗性進行研究。

將得到的菜豆炭疽菌侵染48 份油豆角，進行抗病資源的篩選。在苗期抗性鑒定時，被測的48 份材料中，高抗材料和抗病材料共有12 份；在成株期莢部抗性鑒定中，抗病材料有11 份。通過兩者的比較，發(fā)現(xiàn)在苗期和成株期都表現(xiàn)為抗病的只有6 個品種，分別是中華油豆、九月油、日引油豆3、五常大油豆、6 號架豆、五常油豆和紫花油豆，表明這6 個品種在整個生長階段持續(xù)抗病能力較強。

Pastor-Corrales（1989）通過試驗證明菜豆對炭疽病有四種不同的抗性機制。第一類為整個生育期抗病；第二類為幼苗期高度感病，而成株期抗?。坏谌悶檎麄€生育期中等感??；第四類為整個生育期中等抗病。在菜豆個體中存在著苗期和成株期抗性不一致的現(xiàn)象，即階段抗病性。苗期鑒定只能作為抗性鑒定的一個參考。油豆角的食用部分為豆莢，如果苗期抗病而成株期感病，油豆角的苗期抗性也就失去了意義。即使苗期鑒定為抗病品種，成株期也必須再進行一次鑒定以保證其整個生育期都能抗病，保證其最終的食用品質(zhì)。也就是說，只有在苗期和成株期都抗病的品種才是我們需要并且值得推廣的品種。

在生物學(xué)統(tǒng)計中，相關(guān)系數(shù)的大小和樣本數(shù)（N）有關(guān)，本試驗的48 份油豆角材料中，葉抗病性與莢抗病性的Kendall 相關(guān)系數(shù)為0.315，Spearman 相關(guān)系數(shù)為0.411，均表現(xiàn)為極顯著相關(guān)，結(jié)果與李永鎬等（1992）的試驗結(jié)果r=0.679 6（顯著相關(guān)）類似，而與Araya-Fernandez等（1987）的試驗結(jié)果（r=0.26）不同。李梅（2009）的研究表明，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的炭疽病菌的致病力是不同的，不同的培養(yǎng)時間、不同的接種濃度都會對抗性鑒定結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，另外，所研究的油豆角品種基因型的差異，接種孢子懸浮液的濃度及噴霧的均勻程度等人為因素都會造成抗性鑒定結(jié)果的不一致性。因此，在以后的研究工作中應(yīng)進一步擴大鑒定的品種數(shù)量，盡量減小人為誤差對試驗結(jié)果的影響，并且深入研究不同油豆角品種的抗性機理，從橫向和縱向兩個方面整體把握油豆角的階段性抗病本質(zhì)。

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