橘紅色形態(tài)標(biāo)記在抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系轉(zhuǎn)育中的應(yīng)用

耿新翠 沈向群 李 茜 陳永浩 郭艷峰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

根腫病由根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引起，是十字花科作物的一種專(zhuān)性寄生病害，在世界上許多國(guó)家都有發(fā)生，并且給十字花科作物生產(chǎn)造成了巨大損失。大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕由于生長(zhǎng)期長(zhǎng)、生長(zhǎng)期間氣候條件適宜根腫菌侵染而發(fā)病更加嚴(yán)重（Dixon，2009）。近年來(lái)我國(guó)根腫病發(fā)病面積逐年擴(kuò)大，大白菜、普通白菜等十字花科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降（孫保亞和沈向群，2005）。橘紅心大白菜是大白菜中的稀有顏色，營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值比普通大白菜高出許多倍（張德雙 等，2004），是大白菜球心色和品質(zhì)育種的一個(gè)有價(jià)值的發(fā)展方向。但是根腫病發(fā)病面積的迅速擴(kuò)大勢(shì)必影響到橘紅心大白菜在我國(guó)的栽培，轉(zhuǎn)育橘紅心大白菜抗根腫病雄性不育系雖然是解決根腫病為害的一個(gè)有效手段，但是轉(zhuǎn)育過(guò)程中需要進(jìn)行抗性鑒定、育性調(diào)查和球心色篩選，這是一個(gè)繁瑣的過(guò)程。

形態(tài)標(biāo)記具有直觀、簡(jiǎn)單、無(wú)需任何分析就可以直接得到結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，是所有標(biāo)記方法中最簡(jiǎn)單、最直觀、最經(jīng)濟(jì)的方法，也是遺傳研究和雜種鑒定常用的傳統(tǒng)方法（龐金安 等，2009）。利用形態(tài)標(biāo)記可以提高種子純度和選育效率（吳新杰 等，2005）。隨著雜種優(yōu)勢(shì)的利用和發(fā)展，形態(tài)標(biāo)記在雜種鑒別、純度鑒定和品種權(quán)益保護(hù)中具有重要意義。橘紅心大白菜的球心色由1對(duì)隱性等位基因控制（余陽(yáng)俊 等，1993），花色、子葉顏色與球心色的遺傳關(guān)系是一因多效，根據(jù)子葉顏色或花色就能判斷其球心色，可以把子葉顏色和花色作為橘紅心大白菜的形態(tài)標(biāo)記性狀在育種中加以應(yīng)用（李躍飛，2011）。本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)育抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系的過(guò)程中用球心色法、子葉法和花色法分別篩選橘紅心性狀，對(duì)這3 種方法的應(yīng)用過(guò)程進(jìn)行比較、分析，提出了簡(jiǎn)化抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系轉(zhuǎn)育進(jìn)程的方法，為橘紅心大白菜形態(tài)標(biāo)記在育種中的應(yīng)用提供了一定的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗根腫病白心大白菜甲型兩用系（CRAB9112A）與橘紅心大白菜自交系LH 雜交后代F1分別進(jìn)行回交和系內(nèi)交得到的BC1F1和F2，回交親本為L(zhǎng)H。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)于2010～2011年在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地進(jìn)行。

第1 組試驗(yàn)于2010年7月2日進(jìn)行，BC1F1和F2種子各2 份，第1 份浸種后放在培養(yǎng)皿中，室溫暗箱條件下培養(yǎng)，子葉展開(kāi)（2～3 d）后，置于陽(yáng)光下2 h 后調(diào)查子葉顏色，7月5日統(tǒng)計(jì)橘紅色子葉和黃色子葉的幼苗數(shù)目，橘紅色子葉幼苗與第2 份種子同時(shí)進(jìn)行抗性鑒定，8月7日進(jìn)行抗性調(diào)查，抗病的植株栽到大田中，結(jié)球期第1 份調(diào)查經(jīng)濟(jì)性狀，第2 份調(diào)查經(jīng)濟(jì)性狀和球心色。11月初收獲后，存放在地窖中。立春前后栽到花盆中，開(kāi)花后調(diào)查育性。

第2 組試驗(yàn)于2010年6月進(jìn)行，BC1F1和F2種子各2 份，分別浸種催芽后春化（0～3 ℃，遮光）處理30 d（6月5日～7月5日），春化結(jié)束后第1 份置于陽(yáng)光下2 h 后，統(tǒng)計(jì)橘紅色子葉和黃色子葉的幼苗數(shù)目，橘紅色子葉幼苗與第2 份同時(shí)（7月5日）進(jìn)行抗性鑒定，8月7日進(jìn)行抗性調(diào)查，抗病的植株栽到穴盤(pán)內(nèi)（50 穴·盤(pán)-1），開(kāi)花后分別調(diào)查花色、育性。

1.2.2 抗性篩選方法 采用菌土置入法接菌，供試菌種為沈陽(yáng)新民大白菜主產(chǎn)區(qū)采集的根腫病菌。按照15 g 鮮質(zhì)量病根配制100 mL 菌液〔利用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液孢子濃度，應(yīng)達(dá)到12×107個(gè)·mL-1（高橋賢司和劉學(xué)敏，1989）〕加入300 g 風(fēng)干草炭土的比例配制菌土，在23～28 ℃條件下密封48 h，使其充分發(fā)酵。將發(fā)酵過(guò)的菌土放入每穴的中央（50 穴·盤(pán)-1），每穴放菌土9 cm3，種子或芽保證播到菌土上，苗床地溫控制在25 ℃左右，土壤濕度保持在90%左右，pH值控制在6～7，為植株發(fā)病營(yíng)造良好條件，30 d 后洗根，進(jìn)行調(diào)查。

1.2.3 樣本容量 樣本容量按n≥lg（0.01）/lg（1-p）求得，式中n為樣本容量，p為目標(biāo)基因發(fā)生概率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗根腫病橘紅心大白菜篩選過(guò)程比較

抗根腫病橘紅心大白菜不育系轉(zhuǎn)育時(shí)第2 代（F1進(jìn)行回交或系內(nèi)交得到的）是得到橘紅心植株的關(guān)鍵步驟。非種子春化處理時(shí)，球心色法先抗性篩選，抗病植株球心色和經(jīng)濟(jì)性狀的篩選在大田里同時(shí)進(jìn)行，然后在經(jīng)濟(jì)性狀符合要求的抗病橘紅心植株中進(jìn)行育性調(diào)查，得到需要的育性基因型；子葉法先調(diào)查子葉顏色，只有橘紅色子葉幼苗進(jìn)行抗性篩選，抗病橘紅心植株進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查，符合要求的做育性調(diào)查。子葉法和球心色法相比，抗性篩選和球心色（或子葉色）調(diào)查先后順序不同，但都是最后進(jìn)行育性鑒定。具體過(guò)程如圖1所示。從表面看，利用子葉法篩選橘紅心植株似乎更繁瑣，其實(shí)不然，子葉法操作簡(jiǎn)單方便，僅需要2～3 d 就可以完成，可以說(shuō)兩種方法在時(shí)間耗用上幾乎是一樣的。

圖1 非種子春化處理抗根腫病橘紅心大白菜篩選方法比較

種子春化處理時(shí)幼苗不經(jīng)過(guò)結(jié)球期直接進(jìn)入開(kāi)花期，通過(guò)子葉顏色和花瓣顏色都可以找到橘紅心植株，所以橘紅花和橘紅子葉都可以作為形態(tài)標(biāo)記性狀用于篩選橘紅心植株，但是二者在具體應(yīng)用時(shí)有所不同。花色法在春化處理結(jié)束后進(jìn)行抗性篩選，抗病植株開(kāi)花后花色和育性調(diào)查同時(shí)進(jìn)行。而子葉法在春化處理結(jié)束后，幼苗先在陽(yáng)光下照射2 h，橘紅心幼苗子葉顏色由黃色變?yōu)殚偌t色而白心幼苗子葉依然是黃色，淘汰黃色子葉幼苗，橘紅色子葉幼苗進(jìn)行抗性鑒定，抗病橘紅心植株開(kāi)花后調(diào)查育性。具體過(guò)程如圖2所示。可以看出，與非種子春化處理類(lèi)似，子葉法和花色法相比，也是抗性篩選和花色（或子葉色）調(diào)查順序不同，耗用時(shí)間幾乎一樣。

圖2 種子春化處理抗根腫病橘紅心大白菜篩選方法比較

因此，球心色法、花色法和子葉法相比，球心色法是經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查和球心色調(diào)查同時(shí)進(jìn)行，花色法是花色調(diào)查和育性調(diào)查同時(shí)進(jìn)行，而子葉法是子葉色、抗性、經(jīng)濟(jì)性狀、育性逐一篩選。另外，子葉法在種子春化處理和非種子春化處理應(yīng)用過(guò)程基本相同，只是種子春化處理少了田間經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查這一階段。

2.2 不同方法篩選理想橘紅心植株各步驟比較

在轉(zhuǎn)育抗根腫病橘紅心大白菜核基因雄性不育系過(guò)程中，無(wú)論是種子春化處理，還是非種子春化處理，抗性篩選、球心色調(diào)查和育性調(diào)查缺一不可。方法和材料不同時(shí)，抗性篩選、球心色調(diào)查所需要的株數(shù)也會(huì)不同。

當(dāng)F1通過(guò)回交得到橘紅心植株時(shí)，BC1F1抗病和感病、白心和橘紅心、可育和不育的理論分離比都是1∶1。非種子春化處理，球心色法每一份材料需要40 株進(jìn)行抗性篩選，選出的抗病植株約20 株進(jìn)行球心色和經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查，最后選7 株抗病橘紅心植株進(jìn)行育性調(diào)查（表1）。子葉法先從40 株子葉展開(kāi)的幼苗中淘汰子葉黃色的幼苗，保留橘紅色子葉的幼苗約20 株進(jìn)行抗性篩選，抗病植株10 株左右進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性狀篩選，選7 株進(jìn)行育性調(diào)查（表2）。在調(diào)查總數(shù)相同的情況下，子葉法抗性篩選株數(shù)、經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查株數(shù)只有球心色法的50%左右。

種子春化處理時(shí)，子葉法在春化處理后先調(diào)查40 株幼苗子葉顏色，橘紅色子葉幼苗約20 株進(jìn)行抗性篩選，選7 株抗病橘紅心植株盆栽進(jìn)行育性調(diào)查（表3）?；ㄉㄏ葘?duì)40 株幼苗進(jìn)行抗性篩選，抗病植株約20 株盆栽進(jìn)行花色和育性調(diào)查（表4）?；ㄉㄐ枰剐院Y選和育性調(diào)查株數(shù)多，而子葉法在抗性鑒定前淘汰了非橘紅心幼苗，抗性篩選和育性調(diào)查株數(shù)大大減少。

除了抗性篩選株數(shù)和育性調(diào)查株數(shù)不同外，從調(diào)查過(guò)程所需時(shí)間來(lái)看，非種子春化處理子葉法和球心色法相比，子葉法比球心色法多了子葉調(diào)查這一步驟，但是從各個(gè)步驟所需要的時(shí)間來(lái)看，抗性篩選30 d，經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查100 d 左右，子葉調(diào)查僅僅需要2～3 d 的時(shí)間。同樣，種子春化處理子葉法也是多了子葉顏色調(diào)查這一步驟，但是這一步驟費(fèi)時(shí)更短，僅僅需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間。可以說(shuō)，從BC1F1獲得理想橘紅心植株，球心色法和子葉法或者花色法和子葉法所需時(shí)間差別不大，但子葉法不僅抗性篩選株數(shù)少，大田種植或盆栽株數(shù)也減少許多，這意味著在管理過(guò)程中工作強(qiáng)度降低，節(jié)省了人力和物力。

F1兄妹交得到橘紅心植株（F2），抗病和感病理論分離比是3∶1，抗病植株較多，約占總株數(shù)的3/4，白心和橘紅心理論分離比是3∶1，但橘紅心植株約占總株數(shù)的1/4；育性基因型理論分離比為1∶1∶1∶1（MS fMS∶MS fms∶msms∶Msms）。在這種情況下，為了得到理想的基因型，子葉法更加顯示出其優(yōu)勢(shì)（表5～8）：在總調(diào)查株數(shù)為96 株的前提下，先確定橘紅心植株，淘汰了約占總數(shù)3/4 的非橘紅心植株，只有1/4 橘紅心幼苗進(jìn)行抗性篩選，而其他方法抗性篩選株數(shù)都是96 株；相應(yīng)地，非種子春化處理子葉法大田種植株數(shù)大約為球心色法的1/3，種子春化處理子葉法盆栽株數(shù)大致為花色法的1/3。由此可見(jiàn)，從F2篩選理想的橘紅心植株，子葉法依然是最簡(jiǎn)便、省力的方法。

表1 非種子春化處理球心色法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表2 非種子春化處理子葉法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表3 種子春化處理子葉法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表4 種子春化處理花色法從BC1F1獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

與BC1F1獲得理想橘紅心植株相比，F(xiàn)2要獲得理想橘紅心植株，球心色法抗性篩選株數(shù)、經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查株數(shù)和育性調(diào)查株數(shù)明顯增加；花色法抗性篩選株數(shù)、盆栽株數(shù)也明顯增加；子葉法先淘汰了約占總數(shù)3/4 非橘紅心幼苗，抗性篩選總數(shù)反而明顯減少。因此，當(dāng)橘紅心植株出現(xiàn)的概率由回交時(shí)的1/2 降為系內(nèi)交的1/4，調(diào)查總數(shù)增加時(shí)，子葉法由于首先淘汰了占多數(shù)的非橘紅心植株而使隨后的抗性、經(jīng)濟(jì)性狀和育性調(diào)查株數(shù)大幅縮減，這對(duì)于后期的管理工作十分有利，這說(shuō)明隨著橘紅心出現(xiàn)概率的降低，子葉法變得更加方便、實(shí)用。

2.3 不同方法根腫菌菌土用量比較

抗性鑒定時(shí)，每穴放菌土9 cm3，定苗2株。從表9 可以看出，材料相同時(shí)，球心色法和花色法菌土耗用量相同，子葉法菌土耗用量較少；材料不同時(shí)，同一種方法菌土耗用量不同。F2獲得抗病橘紅心植株的概率（3/16）低于BC1F1（1/4），所以F2調(diào)查群體增加，球心色法和花色法菌土耗用量也相應(yīng)增加。但是，由于F2獲得抗病植株的概率（3/4）高于BC1F1（1/2），子葉法的抗性篩選群體反而減少，菌土耗用量低于BC1F1。這說(shuō)明在轉(zhuǎn)育橘紅心材料時(shí)，子葉法可以先淘汰非橘紅心植株，省去了非橘紅心材料的抗性篩選，減少了抗性篩選群體，節(jié)省了菌土。

表5 非種子春化處理球心色法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表6 非種子春化處理子葉法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表7 種子春化處理子葉法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表8 種子春化處理花色法從F2獲得理想橘紅心植株各步驟調(diào)查株數(shù) 株

表9 不同條件下、不同方法BC1F1和F2獲得抗根腫病橘紅心植株抗性篩選所需菌土量比較

3 結(jié)論與討論

形態(tài)標(biāo)記性狀除了穩(wěn)定性強(qiáng)之外，特征必須明顯，易于識(shí)別，如果能夠早期識(shí)別更好（龐金安 等，2009）。橘紅色子葉對(duì)黃色子葉、橘紅花對(duì)黃花顏色差別明顯，容易區(qū)分，適合作為形態(tài)標(biāo)記加以運(yùn)用。非種子春化處理，橘紅花形態(tài)標(biāo)記在植株生長(zhǎng)后期開(kāi)花期才得以表現(xiàn)，比球心色表現(xiàn)的晚，所以沒(méi)有必要使用。如果不調(diào)查經(jīng)濟(jì)性狀直接種子春化處理，可以在花期利用這一性狀確定橘紅心植株，但管理的工作量會(huì)增加。橘紅色子葉形態(tài)標(biāo)記在種子子葉展開(kāi)時(shí)就表現(xiàn)出來(lái)，可以早期識(shí)別橘紅心植株，并且無(wú)論非種子春化處理還是種子春化處理都可以在幼苗期將橘紅心植株挑選出來(lái)，應(yīng)用價(jià)值較高。

本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)育抗根腫病橘紅心大白菜雄性不育系的BC1F1和F2為試材，在非種子春化處理和種子春化處理兩種條件下比較了球心色法、子葉法和花色法得到抗根腫病橘紅心植株的過(guò)程，得出如下結(jié)論：第一，球心色法是經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查和球心色調(diào)查同時(shí)進(jìn)行，花色法是花色調(diào)查和育性調(diào)查同時(shí)進(jìn)行，子葉法是子葉色、抗性、經(jīng)濟(jì)性狀、育性逐一篩選。第二，非種子春化處理，子葉法比球心色法抗性鑒定群體小，田間調(diào)查株數(shù)少；種子春化處理子葉法比花色法抗性鑒定群體小，盆栽株數(shù)少。第三，F(xiàn)2樣本容量雖然比BC1F1大，但子葉法的抗性鑒定群體反而減少。這說(shuō)明在橘紅心植株出現(xiàn)的概率較小調(diào)查群體增加時(shí)，子葉法可以早期淘汰非橘紅心植株，減少勞動(dòng)量，方便以后的管理。第四，從根腫菌菌土耗用量來(lái)看，子葉法需要的菌土量最少，抗性鑒定結(jié)束后需要滅菌的土量也最少。根腫菌休眠孢子生活力很強(qiáng)，在土壤中可以存活10 a以上。化學(xué)藥劑防治困難，同時(shí)還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染等問(wèn)題。子葉法在抗性鑒定時(shí)減少了菌土耗用量，也就是說(shuō)抗性鑒定結(jié)束后要處理的帶菌土量也隨之減少，這對(duì)于減少或防止試驗(yàn)后根腫菌污染也是有利的。因此，球心色法、子葉法和花色法3 種方法中，子葉法適用范圍最廣，最經(jīng)濟(jì)，最方便，是篩選橘紅心抗病品種和不育系的理想方法。

高橋賢司，劉學(xué)敏．1989．十字花科蔬菜根腫病休眠孢子簡(jiǎn)易定量分析法．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)譯叢，（3）：43-45．

李躍飛．2011．大白菜桔紅心和黃心性狀的分子標(biāo)記及基因定位〔博士論文〕．沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)．

龐金安，李淑菊，霍振榮．2009．黃瓜形態(tài)標(biāo)記研究進(jìn)展．天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，9（4）：28-31．

孫保亞，沈向群．2005．十字花科植物根腫病及抗病育種研究進(jìn)展．中國(guó)蔬菜，（4）：34-37．

吳新杰，陳鳳祥，胡寶成，李強(qiáng)生，侯樹(shù)敏，費(fèi)維新，黃曉榮，江瑩芬．2005．甘藍(lán)型油菜形態(tài)標(biāo)記性狀研究進(jìn)展．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，21（12）：128-131．

余陽(yáng)俊，陳廣，段建雄．1993．大白菜球色的遺傳．北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，11（5）：18-19．

張德雙，徐家炳，張鳳蘭．2004．不同球色大白菜主要營(yíng)養(yǎng)成分分析．中國(guó)蔬菜，（3）：37．

Dixon G R．2009．The occurrence and economic impact ofPlasmodiophora brassicaeand clubroot disease．Plant Growth Regul，28：194-200．