白菜類作物葉片長(zhǎng)寬性狀QTL定位分析

鄧 杰 王 輝 程 鋒 武 劍 王曉武

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，中-荷聯(lián)合園藝作物基因組技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

白菜類蔬菜是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）蕓薹種（B.campestrisL.）中的栽培亞種群。它包含白菜亞種〔ssp.chinensis（L.）Makino〕、大白菜亞種〔ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕、蕪菁亞種（ssp.rapiferaMetzg）。隨著栽培歷史的發(fā)展，在這些亞種中又有變種、類型及其品種的逐漸分化，已成為我國(guó)栽培蔬菜中龐大的亞種、變種及其品種的群體。

葉部是白菜類作物的主要食用部位，也是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。對(duì)白菜類作物葉片性狀的深入研究對(duì)提高其產(chǎn)量和選擇不同葉片表型的育種材料具有重要的意義。目前，對(duì)白菜類作物的QTL 研究主要集中在抗病性（Matsumoto et al.，1998；盧鋼 等，2002）、抗逆性和抽薹開花（Axelsson et al.，2001；Kole et al.，2002；于拴倉(cāng) 等，2004）等方面，專門針對(duì)葉部形態(tài)學(xué)進(jìn)行QTL 定位的研究工作還較少。本試驗(yàn)利用兩個(gè)白菜類作物DH 群體和已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，針對(duì)葉長(zhǎng)、葉寬及葉片形態(tài)指數(shù)性狀進(jìn)行QTL 定位和分析，這將為白菜類作物分子標(biāo)記輔助育種起到積極的推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 DH 群體和遺傳連鎖圖譜

本試驗(yàn)使用2 個(gè)DH 親本Z16〔大白菜，Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕和L143（白菜型油菜，Brassica campestrisL.var.yellow sarsonPrain）及1 個(gè)多代自交親本蘇州青〔普通白菜，BrassicacampestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕構(gòu)建了2 個(gè)各含有120 個(gè)株系的DH 群體：Z16_L143 BC2DH 和Z16_SZQ F1DH。用于構(gòu)建群體的親本間在葉片形態(tài)方面存在顯著差異。利用已構(gòu)建的上述2 個(gè)群體分別具有143、230 個(gè)InDel 標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜對(duì)葉片形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行QTL 分析。

1.2 群體種植和性狀調(diào)查

由于供試群體存在易抽薹的現(xiàn)象，將Z16_SZQ F1DH 群體于2011年5月播種于紗棚中，Z16_L143 BC2DH 群體于2011年10月播種于溫室中，上述試驗(yàn)均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。群體內(nèi)每株系3 次重復(fù)，常規(guī)栽培管理。播種后約60 d 在株系抽薹開花之前選取自外層起第5 片或第6 片完整無缺損的葉片，進(jìn)行拍照并掃描，利用+LA-S 全能型植物圖像分析系統(tǒng)測(cè)量葉長(zhǎng)（LL）、葉寬（LW），計(jì)算葉片形態(tài)指數(shù)（LW/LL）。性狀測(cè)量的具體標(biāo)準(zhǔn)參照李威等（2009）的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和QTL 分析

基于本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的兩個(gè)DH 群體的分子遺傳圖譜，用MAPQTL 4.0 軟件進(jìn)行葉片形態(tài)學(xué)性狀的QTL 分析。形態(tài)學(xué)性狀數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值進(jìn)行QTL 分析。首先利用置換測(cè)驗(yàn)做1 000 次重復(fù)，估算基因組范圍內(nèi)α=0.05 水平上的LOD 閾值。在本試驗(yàn)中，根據(jù)每個(gè)性狀每條連鎖群Permutation test 檢測(cè)到的95%置信區(qū)間的LOD 值作為閾值。利用區(qū)間作圖法（IM）進(jìn)行QTL 分析，在每條染色體上每隔1 cM 對(duì)QTL 存在的可能性掃描1 次。對(duì)于IM 分析檢測(cè)到的QTL，將最高LOD 值所在位置的標(biāo)記或與其緊密連鎖的標(biāo)記作為協(xié)同因子，對(duì)IM 檢測(cè)到的QTL 進(jìn)行多座位QTL 模型（MQM）檢測(cè)。以連鎖群上LOD 值最高的位置作為QTL 的位置（van Ooijen，1992）。

1.4 白菜類作物自然群體中候選基因表達(dá)量與葉片形態(tài)指數(shù)關(guān)聯(lián)分析

利用包括大白菜、普通白菜、蕪菁、烏塌菜、菜薹等95 份不同材料組成的白菜類作物自然群體（表1），提取植株5～6 片真葉時(shí)期蓮座葉葉片的總RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。該數(shù)據(jù)用于分析植株蓮座期可能候選基因表達(dá)量與葉片形態(tài)指數(shù)之間的相關(guān)性。

表1 白菜類作物自然群體中表達(dá)譜測(cè)序的95 份材料

1.5 候選基因序列分析

BrXTH9基因序列來源于大白菜基因組計(jì)劃公布的全基因組序列及白菜注釋基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/），信號(hào)肽剪接位點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過SignalP 軟件完成（Nielsen et al.，1997）。文中引用的其他物種XTH家族基因均來源于NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），序列比對(duì)通過Clustal W 軟件完成（Altschul et al.，1990）。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間葉部形態(tài)學(xué)性狀的差異以及在DH 群體中的變異

由圖1 可知，親本Z16 葉片形態(tài)指數(shù)（LW/LL）較大，表現(xiàn)為較為寬扁的表型（圖1-A）；SZQ及L143 葉片形態(tài)指數(shù)較小，表現(xiàn)為較為細(xì)長(zhǎng)的葉片表型（圖1-B、C），親本之間存在著顯著差異。在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 群體中，葉片形態(tài)指數(shù)性狀分離明顯（圖1-D～O）。

由表2、3 可知，構(gòu)建DH 群體的親本之間葉柄長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)及葉片形態(tài)指數(shù)性狀經(jīng)過t檢測(cè)，存在顯著的差異。因而用該群體檢測(cè)可能獲得控制葉片相關(guān)性狀的QTL。

圖1 親本葉片形態(tài)指數(shù)表型及在DH 群體中的分離情況

表2 Z16_L143 BC2 DH 群體親本葉部形態(tài)學(xué)性狀及在DH 群體中的分布

表3 Z16_SZQ F1 DH 群體親本葉部形態(tài)學(xué)性狀及在DH 群體中的分布

2.2 葉部形態(tài)學(xué)性狀的QTL 定位及基因效應(yīng)分析

利用已構(gòu)建的分子遺傳圖譜，采用多座位QTL 模型對(duì)白菜類作物葉部形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行QTL分析。兩個(gè)DH 群體中，在6 個(gè)連鎖群上共檢測(cè)到9 個(gè)QTLs 位點(diǎn)。其中6 個(gè)QTLs 與葉長(zhǎng)相關(guān)，2 個(gè)QTLs 與葉片形態(tài)指數(shù)相關(guān)，1 個(gè)QTL 與葉寬相關(guān)。這些QTLs 分別位于A01、A03、A05、A06、A09 和A10 上（表4，圖2、3）。

控制葉長(zhǎng)的QTL 在Z16_SZQ F1DH 群體中共檢測(cè)到3 個(gè)，分別命名為L(zhǎng)L-1、LL-2 和LL-3，分別位于A01、A06 與A09 連鎖群上。3 個(gè)QTLs 解釋的遺傳貢獻(xiàn)率在7.1%～13.4%之間，其中LL-3 的遺傳貢獻(xiàn)率最小，LL-1 為減效位點(diǎn)，LL-2 和LL-3 為增效位點(diǎn)（表4）。這3 個(gè)QTLs 解釋的總變異為29.0%。

表4 葉部形態(tài)學(xué)性狀的QTL定位及其基因效應(yīng)

圖2 葉部形態(tài)學(xué)性狀QTL在Z16_SZQ F1 DH 群體分子遺傳圖上的分布

圖3 葉部形態(tài)學(xué)性狀QTL在Z16_L143 BC2 DH 群體分子遺傳圖上的分布

同時(shí)在Z16_L143 BC2DH 群體中也檢測(cè)到3 個(gè)控制葉長(zhǎng)的QTLs，分別命名為L(zhǎng)L-4、LL-5 和LL-6，分別位于A03、A09 與A10 連鎖群上。這3 個(gè)QTLs 解釋的遺傳貢獻(xiàn)率在8.4%～12.8%之間，且全部是增效位點(diǎn)，可解釋的總變異為32.3%（表4）。兩個(gè)群體中都在 A09 連鎖群上檢測(cè)到 1 個(gè)控制葉長(zhǎng)的QTL：LL-3 與LL-5。將這2 個(gè)QTLs 兩側(cè)標(biāo)記引物序列分別與大白菜基因組序列（http://brassicadb.org/brad/）比對(duì)，結(jié)果表明BrID10549 和BrID10541 的位置相近且都位于Scaffold000006 上。

圖4 葉片形態(tài)指數(shù)QTL在Z16_SZQ F1 DH 群體A03 連鎖群上的分布

控制葉片形態(tài)指數(shù)（LW/LL）的QTL 在兩個(gè)群體中分別各檢測(cè)到1 個(gè)，都位于A03 連鎖群上。將在Z16_SZQ F1DH 群體中檢測(cè)到控制葉片形態(tài)指數(shù)的QTL 命名為L(zhǎng)W/LL-1，可解釋的遺傳貢獻(xiàn)率為 28.1%，在 Z16_L143 BC2DH 中檢測(cè)到控制葉片形態(tài)指數(shù)的 QTL 命名為L(zhǎng)W/LL-2，可解釋的遺傳貢獻(xiàn)率為15.7%。根據(jù)大白菜基因組計(jì)劃公布的全基因組序列及親本Z16 與蘇州青的重測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記，在Z16_SZQ F1DH 群體中對(duì)檢測(cè)到的控制葉片形態(tài)指數(shù)的QTL 區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記加密。結(jié)果表明在BrID111431 位點(diǎn)處檢測(cè)到1 個(gè)較為顯著的QTL，其LOD 值為6.47，可解釋22.7%的表型變異（圖4）。將在標(biāo)記加密后的Z16_SZQ F1DH 群體及Z16_L143 BC2DH 群體中A03 連鎖群上檢測(cè)到的葉片形態(tài)指數(shù)相關(guān)的QTL 側(cè)翼標(biāo)記引物序列與大白菜基因組序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，BrID10459 位于Scaffold000001 上5388767 位點(diǎn)處，BrID10155位于Scaffold000005 上1335769 位點(diǎn)處，BrID111431 位于Scaffold000001 上4719555 位點(diǎn)處，表明兩個(gè)群體中A03 連鎖群上檢測(cè)到的葉片形態(tài)指數(shù)相關(guān)的QTL 位于染色體上相近的位置。

控制葉寬的QTL 只在Z16_L143 BC2DH 群體中檢測(cè)到1 個(gè)，命名為L(zhǎng)W-1，位于A05 連鎖群上。這個(gè)QTL 解釋的遺傳貢獻(xiàn)率為15.6%，為減效位點(diǎn)，效應(yīng)值為-10.88。

2.3 葉片形態(tài)指數(shù)候選基因分析

對(duì)Z16_SZQ F1DH 群體中檢測(cè)到的葉片形態(tài)指數(shù)A03 連鎖群上QTL 位點(diǎn)處標(biāo)記BrID111431的帶型與葉片形態(tài)指數(shù)表型性狀進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，結(jié)果表明（圖5），葉片形態(tài)指數(shù)最小的10 個(gè)株系其帶型均為b，表明這些株系在該標(biāo)記處的等位基因來源于親本SZQ；而葉片形態(tài)指數(shù)最大的10 個(gè)株系在BrID111431 位點(diǎn)處的帶型均為a，表明這些株系在該位點(diǎn)的等位基因均來源于Z16。上述結(jié)果表明在標(biāo)記BrID111431 位點(diǎn)處，來源于Z16 的等位基因會(huì)導(dǎo)致葉片形態(tài)指數(shù)變大，而來源于SZQ 的等位基因會(huì)導(dǎo)致葉片形態(tài)植株變小。

圖5 Z16_SZQ F1 DH 群體中葉片形態(tài)指數(shù)最大與最小的10 個(gè)株系及其帶型

通過白菜注釋基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/）找到BrID111431 標(biāo)記上下游注釋基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明（表5），該標(biāo)記上下游的各5 個(gè)注釋基因與擬南芥的注釋基因均具有線性關(guān)系，包括細(xì)胞壁松弛與重排的基因（Bra000840）、與激素Aux/IAA 蛋白結(jié)合的基因（Bra000842）、WD40 家族成員基因（Bra000849）、兩個(gè)功能未知的基因（Bra000841、Bra000854）等。

將BrID111431 上下游各5 個(gè)注釋基因的物理位置錨定到A03 連鎖群上Scaffold000001（圖6），分別位于該標(biāo)記上下游各54 Kb、24 Kb 的區(qū)域內(nèi)。

利用95 份白菜類作物構(gòu)成的自然群體表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果，通過SPSS 軟件對(duì)檢測(cè)到的控制葉片形態(tài)指數(shù)QTL 位點(diǎn)：標(biāo)記BrID111431 上下游各5 個(gè)基因的表達(dá)量與田間單株測(cè)量的葉片形態(tài)指數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明（表6），有3 個(gè)白菜注釋基因的表達(dá)量與葉片形態(tài)指數(shù)表現(xiàn)出極顯著的相關(guān)性，分別為Bra000840、Bra000846、Bra000847。Bra000847表達(dá)量與葉片形態(tài)指數(shù)的相關(guān)系數(shù)最高，為0.439。該基因是擬南芥AT4G03070的同源基因，在擬南芥中參與到硫苷合成的相關(guān)途徑中（Kliebenstein et al.，2001），該基因突變或過表達(dá)并不能引起擬南芥葉片表型的突變。Bra000846是擬南芥AT4G03080的直系同源基因，對(duì)BRI1基因有抑制作用，具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用，該基因的突變體也不能引起擬南芥葉片表型變異。注釋基因Bra000840為擬南芥中AtXTH9（AT4G03210）的直系同源基因，屬于XTH基因家族的成員。該基因在細(xì)胞的伸長(zhǎng)及細(xì)胞體積膨大過程中起著十分重要的作用。XTH家族在催化細(xì)胞壁形態(tài)改變的過程中主要有兩個(gè)步驟：首先內(nèi)切木葡聚糖分子，再次將產(chǎn)生的木葡聚糖分子一端連接到另一個(gè)木葡聚糖分子的非還原端，從而對(duì)細(xì)胞的延展性進(jìn)行調(diào)節(jié)。Shin 等（2006）研究表明從白菜類作物中克隆的AtTXTH9的直系同源基因BcXTH1轉(zhuǎn)化到擬南芥中過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蓮座期葉片特異性變寬、葉片形態(tài)指數(shù)變大，生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花莖等器官特異性變長(zhǎng)。本試驗(yàn)中檢測(cè)到的葉片形態(tài)指數(shù)相關(guān)的QTL 定位在標(biāo)記BrID111431 位點(diǎn)上，該標(biāo)記距離BrXTH9基因約54 Kb，為AtXTH9與BcXTH1的直系同源基因，而BrID111431 附近的其他基因在擬南芥突變體庫(kù)中并沒有發(fā)現(xiàn)會(huì)引起表型的變化報(bào)道（http://www.arabidopsis.org/），同時(shí)BrXTH9在95份白菜類作物自然群體中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)與葉片形態(tài)指數(shù)具有極顯著的相關(guān)性，該基因表達(dá)量增大會(huì)伴隨著群體中葉片形態(tài)指數(shù)變大的趨勢(shì)，因而將BrXTH9基因作為可能控制葉片形態(tài)指數(shù)的候選基因。

表5 白菜類作物中葉片形態(tài)指數(shù)A03 連鎖群上QTL區(qū)域注釋基因

圖6 白菜類作物中BrID111431 上下游各5 個(gè)基因及其物理位置

表6 白菜類作物自然群體中BrID111431 上下游10 個(gè)注釋基因表達(dá)量與葉片形態(tài)指數(shù)相關(guān)性

2.4 BrXTH9 序列分析

BrXTH9是從親本Z16 與SZQ 的cDNA 克隆出來的，測(cè)序表明該基因序列全長(zhǎng)為873 bp，共編碼290 個(gè)氨基酸（圖7），兩親本之間該基因的編碼產(chǎn)物無差異。BrXTH9與擬南芥中直系同源基因AtXTH9在核酸水平上的相似性為 88.1%，利用 SignalP 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)BrXTH9氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在N-末端有1 個(gè)可能存在的信號(hào)肽，表明BrXTH9編碼產(chǎn)物可能是分泌蛋白。利用N-X-T/S 模型對(duì)BrXTH9編碼氨基酸的N-末端糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明氨基酸序列中Asn54和Asn108為可能存在的糖基化位點(diǎn)（圖7）。XTH基因保守的結(jié)構(gòu)域（DEIDFEFLG）在BrXTH9編碼氨基酸中位于98～107位點(diǎn)，并存在兩個(gè)氨基酸（NEF DFEFLG）的突變。

圖7 BrXTH9 序列分析

2.5 白菜類作物中BrXTH 基因家族進(jìn)化分析

至今，在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)33 個(gè)XTH基因家族成員，AtXTH1-AtXTH33。而在白菜類作物中只報(bào)道了AtXTH9的直系同源基因BcXTH1，其他XTH基因家族成員仍沒有相關(guān)的報(bào)道。在本試驗(yàn)中，以大白菜基因組計(jì)劃公布的白菜全基因組序列及注釋基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/），在大白菜中共找到了39 個(gè)BrXTH基因家族成員（圖8）。擬南芥33 個(gè)XTH家族成員中的4 個(gè)XTH基因（AtXTH1、AtXTH2、AtXTH20、AtXTH24）在大白菜中沒有找到直系同源基因。大白菜中不同拷貝之間的親緣關(guān)系更近。

確定的大白菜中控制葉片形態(tài)指數(shù)可能的候選基因BrXTH9與擬南芥AtXTH9為直系同源基因，該基因在大白菜中有兩個(gè)拷貝（圖8），AtXTH9可分為獨(dú)立的分支。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，XTHs在大白菜中存在個(gè)拷貝現(xiàn)象，這可能是擬南芥屬與蕓薹屬在進(jìn)化過程中分化后大白菜基因組加倍所造成的。

圖8 XTH 基因家族進(jìn)化分析

3 結(jié)論與討論

葉片大小直接關(guān)系到白菜類作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而葉片形態(tài)指數(shù)又與外觀品質(zhì)緊密相關(guān)，對(duì)這些性狀的QTL 分析及主效位點(diǎn)的確定，將為白菜類作物品質(zhì)改良育種提供依據(jù)。本試驗(yàn)在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 兩個(gè)群體中研究了葉長(zhǎng)、葉寬及葉片形態(tài)指數(shù)3 個(gè)性狀。結(jié)果表明，兩個(gè)群體中都在連鎖群A03 Scaffold000001 上相近的區(qū)域檢測(cè)到1 個(gè)控制葉片形態(tài)指數(shù)的QTL，在連鎖群A09 上都檢測(cè)到1 個(gè)控制葉長(zhǎng)的QTL，但只在1 個(gè)群體中檢測(cè)到針對(duì)葉寬的QTL，可能是該性狀易受到環(huán)境或其他生理?xiàng)l件的影響。

Lou 等（2007）利用L143 與PC-175 構(gòu)建的71 個(gè)株系的DH 群體將葉長(zhǎng)、葉寬及葉片形態(tài)指數(shù)3 個(gè)性狀定位在連鎖群A02、A03、A06 和A09 上，本試驗(yàn)同樣在連鎖群A03 上定位到了葉片形態(tài)指數(shù)的QTL。李威等（2009）利用大白菜材料構(gòu)建的DH 群體對(duì)葉長(zhǎng)與葉寬等性狀進(jìn)行了QTL 分析，在4 條連鎖群上共獲得了12 個(gè)相關(guān)的QTLs，其中在連鎖群A09 上同樣檢測(cè)到1 個(gè)與葉長(zhǎng)相關(guān)的QTL。

通過分析Z16_SZQ F1DH 群體中檢測(cè)到的控制葉片形態(tài)指數(shù)的QTL 區(qū)域，將該QTL 區(qū)域中大白菜與擬南芥注釋基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大白菜基因組中在該區(qū)域存在擬南芥AtXTH9（Hyodo et al.，2003）的直系同源基因，有研究表明白菜型油菜中AtXTH9的直系同源基因BcXTH1與葉片的大小形態(tài)相關(guān)，該基因過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蓮座期葉片特異性變寬，葉片形態(tài)指數(shù)增大（Shin et al.，2006）。本試驗(yàn)中利用95 份白菜類作物的自然群體對(duì)該基因的表達(dá)量與葉片形態(tài)指數(shù)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在極顯著相關(guān)性，BrXTH9基因表達(dá)量高，則葉片形態(tài)指數(shù)有變大的趨勢(shì)。在擬南芥中，AtXTH9編碼產(chǎn)物葡聚糖水解酶蛋白參與細(xì)胞壁的松弛與重排并促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)（Rose et al.，2002），但其具體功能還有待于進(jìn)一步研究。

利用大白菜全基因組信息，本試驗(yàn)分析了大白菜中XTH家族成員的進(jìn)化關(guān)系，相對(duì)于擬南芥33 個(gè)XTH家族中的29 個(gè)成員，在大白菜中共鑒定出了39 個(gè)直系同源基因。通過比對(duì)分析表明BrXTH9與AtXTH9在核酸水平存在很高的序列相似性。擬南芥中XTH成員編碼的氨基酸序列存在1 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域（DEI DFEFLG），但是Hyodo 等（2003）研究表明XTH9存在兩個(gè)氨基酸的替換（NEF DFEFLG），本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了同樣的突變位點(diǎn)。這表明BrXTH9可能與AtXTH9及BcXTH1存在同樣的作用機(jī)制。

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