食品級番茄紅素微乳的質(zhì)量評價

王 晶，劉 寧,3*

（1.乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；3.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086）

番茄紅素（Lycopene）是一種重要的類胡蘿卜素，分子式為C40H56，相對分子質(zhì)量為536.85[1]。番茄紅素不具備β－芷香環(huán)結(jié)構(gòu)[2]，不表現(xiàn)維生素A的生理活性，因此對它研究較少。近20年來，國內(nèi)外越來越多的研究和調(diào)查表明，番茄紅素具有多種優(yōu)越的生理功能。番茄紅素是類胡蘿卜素中最有效的單線態(tài)氧淬滅劑，其抗氧化性是類胡蘿卜素中最強(qiáng)的[3]。番茄紅素現(xiàn)已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、食品添加劑委員會（JECFA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)定為A類營養(yǎng)素，并被50多個國家和地區(qū)作為具有營養(yǎng)與著色雙重作用的食品添加劑。目前，番茄紅素對人體健康的作用日益引起廣泛關(guān)注，成為營養(yǎng)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點。但番茄紅素穩(wěn)定性較差且體內(nèi)生物利用度較低等問題一直未解決。

微乳（Microemulsion,ME）一般是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相按適當(dāng)比例形成的一種均勻、低粘度、熱力學(xué)穩(wěn)定的透明或半透明分散體系[4]。其液滴一般介于10～100 nm。按結(jié)構(gòu)可分為水包油（O/W）型、油包水（W/O）型和雙連續(xù)型微乳。微乳具有毒性小、安全性高、不需特殊設(shè)備即可大量生產(chǎn)等優(yōu)點，因而已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥物等行業(yè)中[5]。本研究制備一合適的O/W型微乳來包封番茄紅素，并分析該載體的性質(zhì)、測定微乳包埋率和穩(wěn)定性以及體外釋放的考察。以制備出較為理想的番茄紅素微乳，克服番茄紅素易被氧化、不溶于水及生物利用度低等不足，提高其在食品中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究用的材料有：檸檬烯（（R）－（+）－Limonene），純度96%，分析純，上海晶純試劑有限公司；番茄紅素，純度90%，分析純，華北制藥股份有限公司；Crelnphor EL－35，Tween 80，油酸乙酯，無水乙醇，乙酸乙酯，丁酸乙酯，二氯甲烷，石油醚，均為分析純，均來自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；水為超純水。

采用的儀器有：UV－1201紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；Delta320型pH計（瑞士梅特勒－托利多有限公司）；HJ－3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇市金南儀器廠）；SYNERGY超純水儀（美國Millipore公司）；ALV5000型動態(tài)光散射儀（DLS）（美國Brookhaven Instruments公司）；透射電鏡（日本日立H－7650）。

1.2 方法

1.2.1 微乳處方的選擇

試驗中初步選取檸檬烯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、大豆油和油酸乙酯作為油相。取5個50 mL燒杯，分別加入各種油相，在各燒杯中均加入過量的番茄紅素，50℃水浴加熱并通入氮氣持續(xù)攪拌5 min后，充分振蕩后離心，取上清液用0.45 μm微孔有機(jī)膜過濾，取等體積的濾液稀釋。吸取稀釋液至容量瓶中稀釋至刻度，在472 nm處測定吸光值，求得番茄紅素在各種油中的飽和溶解度[6]。根據(jù)番茄紅素在油中的溶解度大小確定油相，選擇合適的表面活性劑和助表面活性劑。

1.2.2 擬三元相圖的繪制

相圖制備方法[7]如下：固定復(fù)配表面活性劑和油相的質(zhì)量比例為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1，在磁力攪拌下逐滴加水，充分混合，水浴恒溫（25±1）℃。充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，?dāng)體系由濁變清或由清變濁時，記錄出現(xiàn)相變時的加入的水的質(zhì)量，計算水在體系中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在相圖中標(biāo)出相應(yīng)的點，連接成曲線即得到相圖。外觀為透明或半透明和離心（10 000 r·min－1,30 min）穩(wěn)定不分層，可判為微乳[8]。

1.2.3 微液的形態(tài)觀察

采用透射電鏡觀察微乳形態(tài)。將銅網(wǎng)置于蠟板上滴加2 μL的微乳，然后自然晾干把2%磷鎢酸一滴滴在蠟板上，將晾干的銅網(wǎng)倒覆于染液上，負(fù)染15 min，然后用蒸餾水沖洗、吸干，電鏡觀察[9]。

1.2.4 微乳粒徑的測定

利用DLS測定番茄紅素微乳粒徑。取樣品的用水稀釋（50 mL）在容量瓶中，輕輕混顛倒容量瓶混合。由此產(chǎn)生的乳液1 h后通過動態(tài)光散射儀測定其粒徑[10]。并測定一個月內(nèi)的微乳液的粒徑變化，考察其穩(wěn)定性。

1.2.5 體外釋放度的考察

采用透析袋法。取番茄紅素微乳原液、微乳稀釋液和番茄紅素對照液各1 mL（番茄紅素5 mg·mL－1）。以番茄紅素混懸液為對照液。溫度為37℃，轉(zhuǎn)速50 r·min－1，在預(yù)設(shè)的時間間隔，從溶出杯中抽取2 mL樣品溶液，測定番茄紅素的含量，同時補充相應(yīng)體積相同溫度的溶出介質(zhì)。溶出介質(zhì)模擬腸液（pH為6.8，PBS），比較不同劑型對番茄紅素的釋放率的影響。

1.2.6 微乳包埋率的測定及穩(wěn)定性的考察

1.2.6.1 紫外分光光度計測定番茄紅素含量方法的建立

準(zhǔn)確稱取番茄紅素2 mg，用石油醚二氯甲烷溶液（比例為12.5∶1）溶解并定容在25 mL棕色容量瓶中，得濃度為80 μg·mL－1的番茄紅素溶液。準(zhǔn)確吸取上述溶液0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 mL，用石油醚二氯甲烷溶液容于10 mL的棕色容量瓶中，搖勻，得濃度為0.2～3.2 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰浴保存。分別測其吸光值（OD），以O(shè)D為縱坐標(biāo)，番茄紅素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。配制濃度為0.16～2.56 μg·mL－1番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液，以石油醚二氯甲烷溶液為空白對照，于1 d和一周內(nèi)分別重復(fù)測定5次，計算回收率，日內(nèi)精確度和日間精確度。

1.2.6.2 番茄紅素微乳包埋率的測定及穩(wěn)定性考察

稱取一定量的番茄紅素，在氮氣保護(hù)下，95℃加熱下使其溶解于已知量的檸檬烯中，再根據(jù)相圖計算的量滴加乙醇、Tweeen 80和水的混合液，滴加過程中使用磁力攪拌器攪拌。即得含一定量番茄紅素的微乳。采用超速離心法分離微乳[11]，10 000 r·min－1離心2 h，取上層液0.5 mL，用石油醚二氯甲烷溶解，利用紫外分光光度計法測定番茄紅素的含量。被包封的番茄紅素的濃度（C1）。制劑中番茄紅素的總濃度（C0），按下式計算番茄紅素微乳中對番茄紅素的質(zhì)量包封率（Q）。

Q（%）=C1/C0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 微乳配方的選擇

微乳的形成與否取決于所選擇的油水比例和表面活性劑的種類等。而作為食品載體，所選組分必須無刺激性、無毒，食品在微乳中的生物利用度高，形成的微乳區(qū)域較大，對其增溶能力好。試驗選定5種食品級微乳中常用的油相，即，大豆油、檸檬烯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和油酸乙酯。測定各油相對番茄紅素的飽和溶解性。試驗結(jié)果為：乙酸乙酯＜丁酸乙酯＜油酸乙酯＜大豆油＜檸檬烯。因此本試驗選用對番茄紅素溶解度較大的檸檬烯作為制備微乳的油相。微乳制備過程中應(yīng)根據(jù)油相的性質(zhì)和欲制備微乳的類型選擇合適的表面活性劑。一般認(rèn)為，在8～18時形成O/W型微乳。作為食品級的體系表面活性劑的選擇有很大限制。通過HLB值選擇Crelnphor EL－35，Tween 80為表面活性劑，無水乙醇作為助表面活性劑，通過擬三元相圖進(jìn)一步篩選微乳配方的配比。

2.2 擬擬三元相圖的繪制

以檸檬烯作為油相，分別選取表面活性劑Crelnphor EL－35和Tween 80與助表面活性劑乙醇的配比分別為1∶1、2∶1、3∶1的比例作為混合表面活性劑相在（25±1）℃下用滴定法繪制相圖。所得相圖如圖1所示（以下均為質(zhì)量百分比）。

圖1 不同乙醇與Crelnphor EL-35配比下Crelnphor EL-35/乙醇/檸檬烯/水體系的擬三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase of Crelnphor EL-35/ethanol/(R)-(+)-limonene/water system with different weight ratios of ethanol/Crelnphor EL-35

從圖1中可以看出，當(dāng)Crelnphor EL－35與乙醇以2∶1進(jìn)行復(fù)配時微乳相圖中的微乳區(qū)的面積最大，即當(dāng)以檸檬烯作為油相，表面活性劑Crelnphor EL－35/乙醇以2∶1復(fù)配作為混合表面活性劑時，形成的微乳區(qū)域較大。

從圖2中可以看出，當(dāng)Tweeen 80與乙醇以2∶1進(jìn)行復(fù)配時微乳相圖中的微乳區(qū)的面積最大，即當(dāng)以檸檬烯作為油相，表面活性劑Tweeen 80/乙醇以2∶1復(fù)配作為混合表面活性劑時，形成的微乳區(qū)域較大。由圖2可知，Tweeen 80/乙醇以2∶1復(fù)配混合表面活性劑時，形成的微乳區(qū)域最大。即當(dāng)以檸檬烯作為油相，Tweeen 80/乙醇以2∶1復(fù)配混合表面活性劑時，形成的微乳區(qū)域最大。

在相關(guān)文獻(xiàn)中看到，在制備微乳相圖時，大多是將表面活性劑與助表面活性劑進(jìn)行復(fù)配作為混合表面活性劑進(jìn)行微乳的制備。實驗中發(fā)現(xiàn)，以檸檬烯與乙醇復(fù)配作為混合油相，以Tween 80作為表面活性劑在（25±1）℃下用滴定法繪制相圖。所得相圖如圖3所示。

圖2 不同的乙醇與Tween 80配比下Tween 80/乙醇/檸檬烯/水體系的擬三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase of Tween 80/ethanol/(R)-(+)-limonene/water system with different weight ratios of ethanol/Tween 80

圖3 不同的乙醇與檸檬烯配比下Tween 80/乙醇/檸檬烯/水體系的擬三元相圖Fig.3 Pseudo-ternary phase of Tween 80/ethanol/(R)-(+)-limonene/water system with different weight ratios of ethanol/(R)-(+)-limonene

從相圖中可以明顯看到，當(dāng)乙醇與檸檬烯進(jìn)行復(fù)配時所形成的擬三元相圖與先前使用混合表面活性劑所做相圖最大的區(qū)別就是微乳區(qū)域的面積明顯增加。原因是油相的比例越大越不容易形成微乳，助表面活性劑與油進(jìn)行復(fù)配作為混合油相，即可減小油的用量，故形成的微乳區(qū)域會增大。檸檬烯與乙醇的質(zhì)量比為1:2所形成的微乳液區(qū)域最大，但考慮到該微乳液體系包埋番茄紅素，因此應(yīng)盡可能提高油相的含量，故選定檸檬烯與乙醇得最佳配比為1:1。因此最佳的微乳體系為檸檬烯與乙醇1:1作為混合油相，Tween 80作為表面活性劑。

2.3 微乳的形態(tài)觀察

番茄紅素微乳透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，番茄紅素微乳液液滴均為球形，大小分布均勻。粒徑均小于100 nm，達(dá)到微乳的粒徑要求。

圖4 番茄紅素微乳液透射電鏡照片結(jié)果(×100 000)Fig.4 Representative transmission electron microscopy(TEM)image of resulting Lycopene microemulsion(×100 000)

2.4 微乳粒徑的測定

微乳液粒徑是考察微乳液體系穩(wěn)定的重要參數(shù)[13]。通過DLS測定空白微乳的平均粒徑為22 nm，番茄紅素微乳的平均粒徑為（43±2.35）nm。圖5則是粒徑與時間的關(guān)系，實驗中我們僅考慮了更具有實際應(yīng)用意義的O/W型微乳液。從圖5中可以看出無論是空白微乳液還是含有番茄紅素微乳的微乳液在制備后前5 d內(nèi)粒徑稍有增加以后一直保持穩(wěn)定。加入番茄紅素后微乳液的粒徑有所增加。原因是在加入番茄紅素后在界面上需要更多的表面活性劑來增溶番茄紅素因而粒徑有所增加。實驗結(jié)果表明納米級番茄紅素微乳液具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 體外釋放度的考察

番茄紅素微乳（Microemulsion，ME）、微乳稀釋液（Diluted microemulsion，D－ME）與番茄紅素對照液的體外釋放度實驗結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，在模擬腸液（pH為6.8，PBS）釋放介質(zhì)中，微乳和稀釋微乳的釋放速度和程度都明顯大于對照液，稀釋微乳處方的釋放速度快于微乳原液。這可能是因為微乳制劑粒徑較小更利于釋放，而且釋放的程度也更好。有研究指出藥物的體外釋放速率和程度在一定程度上可以反映藥物在體內(nèi)的生物利用度，番茄紅素微乳的體外釋放速度和程度明顯大于對照液，6 h累積釋放量達(dá)90%，說明番茄紅素微乳在一定程度上可提高其生物利用度。原因是微乳可通過提高難溶性藥物的溶解度、增加水溶性藥物的穩(wěn)定性、避免肝首關(guān)效應(yīng)和改善吸收屏障的通透性等機(jī)制，促進(jìn)藥物的吸收，提高其生物利用度[13]。

圖5 微乳液體系粒徑隨儲藏時間的變化曲線Fig.5 Variation of diameter of microemulsion vs.the storage

圖6 番茄紅素微乳原液、微乳稀釋液和對照液在模擬腸液中的溶出曲線Fig.6 Dissolution profiles of lycopene from ME，D-ME，Solution in PBS

2.6 微乳液包埋率的測定及穩(wěn)定性的考察

2.6.1 紫外分光光度法測定番茄紅素的含量

2.6.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在472 nm波長下，測定不同濃度番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值（OD），每個濃度平行測定3次。以吸光值為縱坐標(biāo)，番茄紅素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此計算回歸方程為：y=0.2845x－0.0161，r2=0.9998。

2.6.1.2 方法精密度、回收率實驗

為驗證測定番茄紅素的方法的準(zhǔn)確性需要考察測定方法的精密度和回收率，測定結(jié)果分別見表1、2。

表1 番茄紅素的精密度Table 1 Accuracy of lycopene(n=5)

表2 番茄紅素的回收率Table 2 Recovery of lycopene(n=5)

從表1中可以看出，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差≤2%，日間RSD≤3%，說明采用分光光度計法符合番茄紅素測量方法的要求。從表2中可以看出，回收率良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均≤2%，說明本試驗建立測定番茄紅素的方法的回收率符合要求。

2.6.2 番茄紅素微乳液包封率及穩(wěn)定性的考察

結(jié)果見表3。

實驗中觀察到，番茄紅素微乳于4℃，25℃避光放置1個月未見分層、破乳現(xiàn)象；pH值無明顯變化。在4℃和25℃下放置1個月包封率仍高達(dá)94%以上。說明番茄紅素微乳液具有良好的穩(wěn)定性，但實驗中發(fā)現(xiàn)在25℃下微乳液的包封率稍有減小，因此該微乳液最好低溫、避光、密封保存。

表3 番茄紅素微乳的包封率及穩(wěn)定性Table 3 Lycopene microemulsion entrapment efficiency and stability

3 討論與結(jié)論

通過擬三元相圖法篩選出最佳的微乳配方，得到穩(wěn)定的食品級O/W型番茄紅素微乳液。制備中發(fā)現(xiàn)將助表面活性劑與油進(jìn)行復(fù)配作為混合油相與將表面活性劑與助表面活性劑進(jìn)行復(fù)配作為混合表面活性劑相比，可獲得相對較大的微乳液區(qū)域。Tween 80/乙醇/檸檬烯/水的微乳液制備簡單，所得的微乳液平均粒徑為（43±2.35）nm，包封率高達(dá)97%以上。番茄紅素微乳的體外釋放速度和程度明顯大于對照液，6 h累積釋放量達(dá)90%，可有效提高番茄紅素的穩(wěn)定性及生物利用度。試驗中發(fā)現(xiàn)制備好的番茄紅素微乳在25℃下避光長期儲存，番茄紅素的包封率稍有減小。因此該微乳液應(yīng)低溫、避光、密封保存。用該載體來包封番茄紅素，不僅解決了番茄紅素在應(yīng)用中的水溶性差的問題，而且明顯提高了番茄紅素的穩(wěn)定性。因此將其作為食品生產(chǎn)中的番茄紅素載體具有廣闊的應(yīng)用前景。

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