高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的篩選及誘變育種研究

吳 非，邊 鑫，李 良，吳海波，郭 麗

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150050；3.綏化學(xué)院生物與食品工程系，黑龍江 綏化 152061）

γ－氨基丁酸（γ－aminobuyric acid，GABA）是一種廣泛分布于動(dòng)、植物中的非蛋白質(zhì)氨基酸[1]，是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的抑制性遞質(zhì)。近年來(lái)，隨著對(duì)GABA的研究不斷深入，其降血壓[2]、治療癲癇[3]和焦慮癥[4]等眾多功效相繼被發(fā)現(xiàn)，使得GABA受到食品、醫(yī)療行業(yè)人士的廣泛關(guān)注。因此，如何提高GABA的含量成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前，GABA主要是通過(guò)谷氨酸脫羧酶（GAD）催化谷氨酸轉(zhuǎn)化而成的[5]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、霉菌、酵母菌以及其他微生物中含有這種酶[6－8]，可通過(guò)提取出的GAD催化谷氨酸轉(zhuǎn)化或微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)GABA。本研究從食用級(jí)乳酸菌著手，以豆?jié){（大豆∶水=1∶8）為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，篩選出GABA的高產(chǎn)菌株，然后利用紫外線對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變處理，將得到的突變菌株用含有代謝產(chǎn)物GABA的培養(yǎng)基進(jìn)行抗性初篩，再依次利用含有1%谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基和豆?jié){發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終得到穩(wěn)定高產(chǎn)GABA突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）L1，L2，L12，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.），均由乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

GABA標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；四硼酸鈉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；次氯酸鈉（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；苯酚（沈陽(yáng)東興試劑廠）；乙醇（天津市海濱科迪化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，乙酸鈉5 g，吐溫－80 1 g，檸檬酸二胺2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 豆?jié){的制備

取大豆加水浸泡6～8 h，瀝干后，把泡好的大豆用豆?jié){機(jī)研磨，用紗布過(guò)濾。向豆渣中加入適量的純凈水，充分?jǐn)嚢韬螅V兩次。把3次磨濾制得的漿液混合，再加入適量純凈水混勻，使豆?jié){中大豆和水的比例為1∶8。然后，用八層紗布過(guò)濾4次。

1.2.2 GABA含量的測(cè)定方法

本文采用Berthefot比色法[9]測(cè)定發(fā)酵液中GABA的含量。

1.2.3 乳酸菌菌株的活化

從乳酸菌凍存管中取300 μL菌液，接入10 mL改良MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下活化培養(yǎng)24 h，然后，從10 mL改良MRS液體培養(yǎng)基中吸取1.5 mL菌液于50 mL改良MRS培養(yǎng)基中，40℃下培養(yǎng)18 h。再?gòu)?0 mL改良MRS中吸取3 mL菌液于100 mL改良MRS培養(yǎng)基中，40℃下培養(yǎng)16 h后備用。

1.2.4 高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株篩選

將6株活化的乳酸菌菌株接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，40℃靜置培養(yǎng)至其穩(wěn)定期。取7個(gè)三角瓶分別倒入等量的豆?jié){，用封口膜封好，進(jìn)行巴氏殺菌。殺菌后，取其中一個(gè)三角瓶中的樣品，測(cè)其GABA含量。然后，將不同乳酸菌以3%的接種量分別接到剩下的6個(gè)三角瓶中。在40℃恒溫條件下發(fā)酵12 h。發(fā)酵期間每隔1 h取樣1次，測(cè)定GABA含量，通過(guò)GABA含量的比較，獲得高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株。

1.2.5 高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株紫外誘變、抗性初篩及復(fù)篩

1.2.5.1 菌懸液的制備

將菌株以3%的接種量接種于含1%谷氨酸的改良MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，取20 mL菌液離心（6 000×g，4℃，15 min），棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水將沉淀溶解，調(diào)整菌數(shù)約為108cfu·mL－1，即得菌懸液[10]。

1.2.5.2 紫外誘變處理、抗性初篩及復(fù)篩

取6 mL菌懸液注入9 cm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，先打開紫外燈（18 W，距離45 cm）預(yù)熱20 min，再打開磁力攪拌器，將皿蓋取下，用紫外燈垂直照射10、20、30、40、50和60 s。然后，取照射菌液1 mL分別稀釋102、103、104、105、106、107。再將不同稀釋度的菌液涂布于含適當(dāng)濃度GABA的改良MRS平板上，同時(shí)以未誘變菌株的平板作對(duì)照，避光置于40℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。取致死率在90%以上的單菌落轉(zhuǎn)接于含1%谷氨酸的改良MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下靜置培養(yǎng)24 h后，測(cè)定GABA含量，進(jìn)行抗性初篩，并計(jì)算正突變率。

取GABA含量較高的正突變菌株，分別以3%的接種量接入豆?jié){中，在40℃恒溫條件下發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中GABA最大產(chǎn)量進(jìn)行復(fù)篩，最終獲得高產(chǎn)GABA乳酸菌突變菌株。

1.2.6 高產(chǎn)GABA乳酸菌突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

將經(jīng)過(guò)篩選得到的高產(chǎn)乳酸菌突變菌株連續(xù)傳代12次，每3代取一次菌液進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量，以確定其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)的整理采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行,每組試驗(yàn)樣品均作3個(gè)重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵豆?jié){過(guò)程中GABA積累量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

將6株乳酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，進(jìn)行接菌發(fā)酵，通過(guò)豆?jié){發(fā)酵過(guò)程中GABA積累量篩選出高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株。6株乳酸菌菌株的GABA積累量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況見表1。

由表1可見，豆?jié){本身就含有GABA，含量為0.819 g·L－1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)6株菌株在發(fā)酵2 h左右開始生產(chǎn)GABA，當(dāng)發(fā)酵7 h時(shí)，乳酸乳球菌乳酸亞種的GABA產(chǎn)量首先到達(dá)最大值，為0.702 g·L－1；當(dāng)發(fā)酵8 h時(shí)，保加利亞乳桿菌L2和L12的GABA產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為1.066和0.609 g·L－1；當(dāng)發(fā)酵9 h左右時(shí)，副干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌L1的GABA產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為0.755和0.776 g·L－1；而當(dāng)發(fā)酵到10 h左右時(shí)，嗜熱鏈球菌的GABA產(chǎn)量才達(dá)到最大值，為0.909 g·L－1。通過(guò)對(duì)GABA產(chǎn)量的比較，可以看出，保加利亞乳桿菌L2的GABA產(chǎn)量最大，因此，可以確定保加利亞乳桿菌L2為高產(chǎn)GABA乳酸菌。

表1 乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中GABA積累量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況(ˉ±S)Table 1 GABA accumulation along with the change of fermentation time by Lactobacillus during fermentation

表1 乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中GABA積累量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況(ˉ±S)Table 1 GABA accumulation along with the change of fermentation time by Lactobacillus during fermentation

GABA積累量（g·L－1）Accumulation發(fā)酵時(shí)間（h）Time 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12保加利亞乳桿菌L1 Lactobacillus bulgaricus L1 0.819±0.018 0.831±0.045 0.874±0.100 0.938±0.085 0.996±0.008 1.089±0.011 1.158±0.029 1.265±0.067 1.417±0.092 1.595±0.074 1.381±0.058 1.204±0.071 1.362±0.088保加利亞乳桿菌L12 Lactobacillus bulgaricus L12 0.819±0.078 0.828±0.013 0.849±0.099 0.885±0.063 0.928±0.011 1.012±0.073 1.128±0.023 1.249±0.089 1.428±0.071 1.401±0.055 1.225±0.005 1.323±0.087 1.292±0.051保加利亞乳桿菌L2 Lactobacillus bulgaricus L2 0.819±0.024 0.855±0.141 0.947±0.027 1.074±0.058 1.202±0.011 1.397±0.014 1.539±0.007 1.757±0.042 1.885±0.007 1.830±0.059 1.502±0.072 1.721±0.037 1.639±0.012嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus 0.819±0.053 0.839±0.071 0.853±0.054 0.879±0.082 0.958±0.014 1.038±0.050 1.113±0.078 1.255±0.095 1.473±0.017 1.607±0.043 1.728±0.018 1.622±0.019 1.490±0.041副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei 0.819±0.085 0.839±0.018 0.858±0.064 0.901±0.162 0.973±0.048 1.107±0.017 1.232±0.021 1.388±0.101 1.485±0.028 1.574±0.009 1.433±0.068 1.299±0.023 1.337±0.176乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactis subsp.0.819±0.082 0.845±0.012 0.918±0.054 1.002±0.056 1.119±0.027 1.242±0.018 1.381±0.068 1.521±0.019 1.499±0.071 1.273±0.107 1.365±0.054 1.272±0.107 1.259±0.008

2.2 保加利亞乳桿菌L2紫外誘變時(shí)間的選擇

由于不同菌種對(duì)紫外線敏感程度不同，本試驗(yàn)根據(jù)保加利亞乳桿菌L2的致死率和正突變率來(lái)確定最佳紫外照射時(shí)間，結(jié)果如圖1所示。

圖1 紫外線照射時(shí)間對(duì)保加利亞乳桿菌L2致死率與正突變率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on death rate and positive mutative rate of Lactobacillus bulgaricus L2

夏江、馬燕等研究認(rèn)為，進(jìn)行菌株誘變時(shí)，一般先選取菌株致死率在70%～95%之間所對(duì)應(yīng)的誘變時(shí)間，然后觀察其正突變率，正突變率最大值對(duì)應(yīng)的誘變時(shí)間即為紫外線最佳照射時(shí)間[11－12]。由圖1可以看出，保加利亞乳桿菌L2的致死率隨著紫外照射時(shí)間的增加而逐漸增加，致死率在70%～95%之間所對(duì)應(yīng)的誘變時(shí)間為30～60 s。照射時(shí)間在50 s時(shí)，保加利亞乳桿菌L2的致死率為87%，其正突變率達(dá)到最大值，為66.67%，因此，確定紫外最佳照射時(shí)間為50 s。

2.3 保加利亞乳桿菌L2紫外誘變的抗性初篩、復(fù)篩、二次復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性

將保加利亞乳桿菌L2用紫外線處理50 s后，稀釋涂布于含GABA的改良MRS平板上，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行抗性初篩。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的30個(gè)單菌落接入含有1%L－谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，獲得正突變菌株20株，正突變率為66.67%，正突變菌株的GABA產(chǎn)量見表2。

由表2可知，有三株突變菌株的GABA產(chǎn)量相對(duì)較高，取名為L(zhǎng)2－4、L2－7和L2－22，在含有1%L－谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基中GABA產(chǎn)量分別為4.235、3.921和4.108 g·L－1，比原菌種分別提高了25.63%、16.32%、21.86%。

將L2－4、L2－7和L2－22三株高產(chǎn)GABA正突變菌株接入豆?jié){中發(fā)酵，每隔1 h測(cè)定GABA含量，結(jié)果見表3。

表2 紫外誘變后得到的正突變菌株(ˉ±S)Table 2 Strains of positive mutation by UV mutation

表2 紫外誘變后得到的正突變菌株(ˉ±S)Table 2 Strains of positive mutation by UV mutation

原菌株和正突變菌株Strain and positive mutative strain L2 L2－2 L2－4 L2－5 L2－7 L2－8 L2－9 L2－11 L2－12 L2－14 L2－15 L2－16 L2－17 L2－18 L2－20 L2－22 L2－24 L2－25 L2－26 L2－27 L2－30 GABA產(chǎn)量（g·L－1）Yield 3.371±0.019 3.526±0.110 4.235±0.043 3.802±0.008 3.921±0.029 3.677±0.205 3.522±0.074 3.618±0.021 3.467±0.253 3.545±0.189 3.555±0.005 3.765±0.052 3.492±0.011 3.564±0.072 3.518±0.015 4.108±0.004 3.665±0.012 3.478±0.085 3.713±0.124 3.648±0.077 3.752±0.067

表3 正突變菌株在發(fā)酵豆?jié){過(guò)程中GABA積累量隨時(shí)間變化情況(ˉ±S)Table 3 GABA accumulation along with the change of fermentation time by strains of positive mutation during soya bean milk fermented (g·L-1)

表3 正突變菌株在發(fā)酵豆?jié){過(guò)程中GABA積累量隨時(shí)間變化情況(ˉ±S)Table 3 GABA accumulation along with the change of fermentation time by strains of positive mutation during soya bean milk fermented (g·L-1)

發(fā)酵時(shí)間（h）Time菌株名稱Strain name 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 L2－4 0.819±0.012 0.853±0.052 0.918±0.007 0.975±0.034 1.172±0.032 1.298±0.071 1.427±0.023 1.579±0.013 1.748±0.018 2.213±0.026 1.739±0.045 1.794±0.205 1.721±0.045 L2－7 0.819±0.025 0.844±0.027 0.871±0.021 0.913±0.079 1.089±0.002 1.255±0.017 1.466±0.004 1.762±0.018 1.921±0.082 1.585±0.045 1.649±0.082 1.409±0.098 1.312±0.074 L2－22 0.819±0.019 0.853±0.035 0.909±0.052 0.962±0.047 1.138±0.050 1.241±0.096 1.388±0.037 1.553±0.059 1.792±0.055 2.062±0.021 1.801±0.019 1.757±0.044 1.643±0.031

通過(guò)表3可以發(fā)現(xiàn)，L2－7發(fā)酵到8 h時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值，為1.102 g·L－1；而L2－4和L2－22發(fā)酵到9 h時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為1.394和1.243 g·L－1。3株突變菌株比原菌株的GABA產(chǎn)量分別提高了3.4%、30.77%和16.6%。因此，選取L2－4和L2－22兩株突變菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，圖2為L(zhǎng)2－4和L2－22在傳代12次后，每三代的GABA產(chǎn)量變化情況。

由圖2所示，突變菌株L2－4在連續(xù)傳代12次后，GABA產(chǎn)量比較穩(wěn)定，而突變菌株L2－22的GABA產(chǎn)量明顯下降，說(shuō)明L2－4比L2－22有更穩(wěn)定的產(chǎn)GABA能力。

圖2 紫外誘變篩選的突變菌株產(chǎn)GABA遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of mutant strains producing GABA by UV mutation

綜上所述，通過(guò)紫外誘變獲得了穩(wěn)定的高產(chǎn)GABA突變菌株L2－4，其在1%L－谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基和豆?jié){中GABA產(chǎn)量分別為4.235和1.394 g·L－1，比原菌株的GABA 產(chǎn)量分別提高了25.63%和30.77%。在相同的試驗(yàn)條件下，對(duì)高產(chǎn)GABA突變菌株L2－4的GABA產(chǎn)量進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與該結(jié)果相同。

3 結(jié)論

a.以豆?jié){為發(fā)酵基質(zhì)，通過(guò)比色法測(cè)定豆?jié){中GABA含量，對(duì)6株乳酸菌進(jìn)行篩選結(jié)果表明：保加利亞乳桿菌L2為高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株，GABA產(chǎn)量為1.066 g·L－1。

b.對(duì)保加利亞乳桿菌L2進(jìn)行紫外誘變處理，結(jié)果表明，最佳紫外線照射時(shí)間為50 s。

c.在最佳紫外照射時(shí)間下，篩選出一株穩(wěn)定的高產(chǎn)GABA突變?nèi)樗峋闘2－4，其在含有1%L－谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量為4.235 g·L－1，比原菌株的GABA產(chǎn)量提高了25.63%；同時(shí)，L2－4在豆?jié){中的GABA產(chǎn)量為1.394 g·L－1，比原菌株的產(chǎn)量提高了30.77%。

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