木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

崔艷紅 韓慶功 ?？?魏龍龍 張貝貝 胡志明

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

木質(zhì)素是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定的生物大分子物質(zhì)，在秸稈類物質(zhì)中約占20%，其產(chǎn)量僅次于纖維素。由于動(dòng)物體內(nèi)缺乏降解木質(zhì)素的酶類，因此很難將其作為有效的飼料來源。自然界中，木質(zhì)素的完全降解是真菌、細(xì)菌、放線菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果，其中真菌起著主導(dǎo)作用。趙紅霞等(2002)[1]報(bào)道，在適宜的條件下，白腐真菌的菌絲首先利用其分泌的超纖維素酶溶解表面的蠟質(zhì),然后菌絲進(jìn)入秸稈內(nèi)部，并產(chǎn)生錳過氧化物酶(MnP)、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、纖維素酶、半纖維素酶，降解秸稈中的木質(zhì)素和纖維素，其中起關(guān)鍵作用的是LiP和MnP。目前，關(guān)于木質(zhì)素降解酶的研究主要集中于白腐真菌，其對(duì)木質(zhì)素的降解主要通過分泌胞外降解酶完成，主要有3種：①木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase,LiP)；②錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)；③漆酶(1accase,Lac)[2]。

木質(zhì)層孔菌(F.lignosus)是白腐真菌的一種，產(chǎn)生的胞外酶有木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、漆酶等氧化酶類。Pease等[3]報(bào)道，錳過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解起關(guān)鍵作用。據(jù)調(diào)查，目前在研究木質(zhì)素降解酶的領(lǐng)域?qū)﹀i過氧化物酶研究尚少，而且大多集中在黃孢原毛平革菌和變色栓菌中的錳過氧化物酶。董旭杰等(2006)[4]研究指出，將3種白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶量最高，可達(dá)880.2 U/l。

MnP是一種含鐵血紅素的糖基化過氧化物酶，在Mn2+和H2O2存在時(shí)，MnP能氧化分解芳香環(huán)多聚體，被認(rèn)為是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一。相對(duì)于其它過氧化物酶，MnP的特別之處在于它的底物是有機(jī)酸。其可以氧化Mn2+為Mn3+，而Mn3+可以鰲合有機(jī)酸，這種鰲合物可通過擴(kuò)散離開酶活性中心，去催化氧化二級(jí)底物，如酚化合物、木質(zhì)素相關(guān)復(fù)合物及大分子量氯代木質(zhì)素、氯代酚和許多其它物質(zhì)。其對(duì)木質(zhì)素的降解有賴于大量穩(wěn)定的Mn3+的存在，與其他酶一起能把木質(zhì)素徹底降解為CO2。因?yàn)镸nP的底物專一性弱，具有氧化降解各類芳香族化合物的獨(dú)特能力，因此，在紙漿的生物漂白、有機(jī)污染物的降解、染料的脫色、褐煤的生物降解、農(nóng)業(yè)廢棄物的處理和催化聚合反應(yīng)等方面得到了較多的研究與應(yīng)用[5]。

本試驗(yàn)選用白腐真菌中能產(chǎn)生較高錳過氧化物酶的菌株木質(zhì)層孔菌5.132，研究了不同溫度、碳源、氮源和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株5.132產(chǎn)錳過氧化物酶的影響，以確定其最佳培養(yǎng)條件，并對(duì)錳過氧化物酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為錳過氧化物酶的高效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

木質(zhì)層孔菌[Fomes lignosus(Berk)Coke]，購自中國科學(xué)院微生物研究所，河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院營養(yǎng)教研室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1 000 ml、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g；

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1 000 ml、葡萄糖20.0 g。

1.1.3 儀器設(shè)備

電熱蒸餾水器（北京市光明醫(yī)療儀器廠），數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋（金壇市瑞爾電器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司），SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），722型光柵分光光度計(jì)（山東高密分析儀器廠），分析天平AB240-N（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），802-型離心機(jī)（江蘇金壇大地自動(dòng)化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸液的制備

將木質(zhì)層孔菌接種于滅菌后的斜面PDA固體培養(yǎng)基上活化，向培養(yǎng)5 d的斜面試管內(nèi)加入無菌水，將菌絲洗出到三角瓶內(nèi)，加玻璃珠打碎后，進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。然后接入到250 ml三角瓶中，三角瓶裝液量50 ml、接種量0.2 ml(以孢子計(jì)1.0×106個(gè)/ml）。

1.2.2 粗酶液制備

取木質(zhì)層孔菌液體培養(yǎng)物于離心管中，3 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3 錳過氧化物酶活力測(cè)定

Mn3+是MnP作用的直接產(chǎn)物，在238 nm處測(cè)Mn3+的吸光值是測(cè)定MnP活力的一個(gè)較為靈敏簡(jiǎn)便的方法，此方法稱乳酸鈉法。乳酸鈉法還可用于連續(xù)測(cè)定，具體步驟為：在4 ml反應(yīng)體系中含50 mmol/l（pH值4～5）的乳酸鈉緩沖液3.4 ml、1.6 mmol/l的硫酸錳溶液0.1 ml、粗酶液0.4 ml，預(yù)熱至37℃時(shí)，加1.6 mmol/l的H2O2溶液0.1 ml啟動(dòng)反應(yīng)。在238 nm紫外光處，測(cè)定反應(yīng)4 min內(nèi)的吸光光度值（OD）。在對(duì)照組中，以煮沸滅活15 min酶液代替原酶液，以蒸餾水代替H2O2溶液，其他反應(yīng)物不變。錳過氧化物酶活力定義為每分鐘使1 μmo1/l的Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/l)。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化產(chǎn)酶條件的建立

2.1.1 培養(yǎng)溫度對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響

將分裝好的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基高壓滅菌后，加入5.132孢子懸液,分別在20、25、30、35、40、45℃的恒溫條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后測(cè)定酶活，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出,木質(zhì)層孔菌在25～30℃范圍內(nèi)產(chǎn)酶量急劇上升,在30～35℃范圍內(nèi)產(chǎn)酶量增加緩慢并達(dá)到高峰為185～215 U/l。35℃時(shí)的產(chǎn)酶量是25℃

時(shí)產(chǎn)酶量的2.5倍，溫度高于35℃時(shí)產(chǎn)酶量開始下降，到45℃時(shí)產(chǎn)酶量為70 U/l，與低溫狀態(tài)下的產(chǎn)酶量幾乎無差異。綜合比較，35℃為木質(zhì)層孔菌合成錳過氧化物酶的最佳培養(yǎng)溫度，溫度過高或過低都不利于酶的合成。

2.1.2 不同碳源對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響

本試驗(yàn)在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別選用不同的碳源：葡萄糖（單糖）、蔗糖（二糖）、可溶性淀粉(多糖)、麩皮和小麥秸粉各1.5 g/100 ml，分別接入菌種，靜置培養(yǎng)至第5 d測(cè)定酶活力，發(fā)現(xiàn)酶活力隨不同碳源而異，如圖2所示。

由圖2結(jié)果可知，麩皮和小麥秸粉最適于木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶，酶活力分別高達(dá)578.4 U/l和620.7 U/l,產(chǎn)量高于其他碳源。所以,在5種碳源中,對(duì)木質(zhì)層孔菌錳過氧化物酶合成最有利的是小麥秸粉,其次是麥麩，接下來依次為可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖。

2.1.3 不同氮源對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響

本試驗(yàn)在100 ml PDA基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加小麥秸粉1.5 g做碳源，然后分別加尿素、草酸銨、氯化銨、胰蛋白胨、牛肉膏各0.5 g，接種木質(zhì)層孔菌，培養(yǎng)5 d后進(jìn)行酶活力測(cè)定，考察不同氮源對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可看出，木質(zhì)層孔菌在5種不同氮源培養(yǎng)條件下均有錳過氧化物酶的合成，但錳過氧化物酶產(chǎn)酶活力的差異比較大。氮源為胰蛋白胨時(shí)，錳過氧化物酶的活力最高，為680.5 U/l；以尿素為氮源時(shí)的錳過氧化物酶活力為650.3 U/l，與胰蛋白胨為氮源時(shí)相比酶的活力稍微下降。以牛肉膏為氮源時(shí)，錳過氧化物酶的活力為458.9 U/l；以氯化銨為氮源時(shí)，錳過氧化物酶的活力為369.7 U/l；以草酸銨為氮源時(shí)，錳過氧化物酶的活力最低，為320.5 U/l。由此可見，以胰蛋白胨為氮源時(shí)的錳過氧化物酶的活力最高，尿素次之，隨后為牛肉膏、氯化銨和草酸銨。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響

用基礎(chǔ)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)木質(zhì)層孔菌，每隔24 h測(cè)酶活力，連測(cè)10 d以考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木質(zhì)層孔菌合成錳過氧化物酶的影響，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的量隨時(shí)間的延長而平穩(wěn)上升，在120 h時(shí)出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰，酶活力為938 U/l。此高峰過后，酶活力稍有下降，并在192 h時(shí)酶活力突然升高，此階段為測(cè)定期間的酶活最高峰值，酶活力高達(dá)1 180.3 U/l，高峰過后錳過氧化物酶的活力大幅度下降。

2.2 酶作用特性的研究

2.2.1 酶作用最適溫度

分別將優(yōu)化條件下提取的粗酶液在32、37、42、47、52、57、62℃進(jìn)行酶解反應(yīng)，測(cè)定不同溫度下錳過氧化物酶的相對(duì)活力（原粗酶液相對(duì)酶活為100%），結(jié)果見圖5。

一般而言，在酶沒有發(fā)生變性之前，其酶活會(huì)隨反應(yīng)溫度的增加而增強(qiáng),從圖5中的曲線圖可以看出,在32～47℃溫度范圍內(nèi),錳過氧化物酶的相對(duì)酶活隨溫度的升高而逐漸增大,在52℃時(shí),相對(duì)酶活達(dá)到最大,繼續(xù)升高溫度,錳過氧化物酶的相對(duì)酶活呈快速下降趨勢(shì)，說明溫度高于52℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致錳過氧化物酶發(fā)生部分結(jié)構(gòu)的變性，從而導(dǎo)致相對(duì)酶活大大降低。

2.2.2 酶作用最適pH值

真菌在酸性條件下木質(zhì)素降解酶活性最高，但不同的菌種有不同的最適pH值范圍。將提取的粗酶液分別于pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的50 mmol/l醋酸-醋酸鈉緩沖液中進(jìn)行酶解反應(yīng)，測(cè)定不同pH值情況下的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6結(jié)果顯示，木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶和大多數(shù)白腐真菌木質(zhì)素降解酶系一樣，有相對(duì)狹窄的最佳pH值范圍。錳過氧化物酶在pH值4～5范圍內(nèi)酶活力比較穩(wěn)定，其相對(duì)酶活力均能維持在70%以上，并在pH值4.5時(shí)相對(duì)酶活力最高，達(dá)89%。

2.2.3 金屬離子對(duì)酶作用特性的影響

本試驗(yàn)在粗酶液中分別加入1 mmol/l的CuSO4·5H2O、MgSO4、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4、AgNO3各1 ml，考察在不同金屬離子存在的條件下錳過氧化物酶的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，在有Zn2+和Ca2+存在的環(huán)境下，錳過氧化物酶的相對(duì)酶活力大于100%，其對(duì)MnP的活性有促進(jìn)作用；Mg2+存在的環(huán)境中相對(duì)酶活達(dá)98.7%，對(duì)MnP的活力影響不是很大；而在Cu2+、Fe2+和Ag+存在的環(huán)境下，可使錳過氧化物酶的相對(duì)活力下降，對(duì)錳過氧化物酶活力具有抑制作用，其中Fe2+的抑制作用最強(qiáng)。

3 討論

3.1 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

碳源是構(gòu)成菌體碳架及能量的來源，真菌細(xì)胞干重的一半是由碳組成的，由此可見，碳源在真菌生長過程中占有很重要的地位。小麥秸粉作為最佳碳源,其錳過氧化物酶的產(chǎn)量與以麩皮為碳源時(shí)的產(chǎn)量相差不大，比以可溶性淀粉為碳源時(shí)高1.6倍，比以葡萄糖為碳源時(shí)高1.8倍，比以蔗糖為碳源時(shí)高2.3倍。本試驗(yàn)結(jié)果與楊曉寬等（2004）[6]報(bào)道的白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶最佳碳源為葡萄糖的試驗(yàn)結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步的研究。

氮源是合成菌體蛋白、核酸等含氮物質(zhì)的重要組成成分。不同氮源對(duì)真菌菌絲體的生長有不同程度的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以胰蛋白胨為氮源時(shí)的錳過氧化物酶活力最高，尿素次之，隨后為牛肉膏、氯化銨和草酸銨。由此可推出有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于錳過氧化物酶的合成，但考慮到蛋白胨實(shí)際含氮量不恒定，并且利用尿素代替胰蛋白胨為氮源，可節(jié)約生產(chǎn)成本，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。此試驗(yàn)結(jié)果與董旭杰等[7]報(bào)道的木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的氮源優(yōu)劣順序相似。

在培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響中，試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長酶量逐漸提高，培養(yǎng)至第5 d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰，之后有所下降，至第8 d又出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰，之后酶活力大幅度下降。分析在最初培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌株的生長，所以酶活力比較低，隨菌體的生長，其產(chǎn)酶量開始上升，并在第8 d達(dá)到最高峰為1 180.3 U/l，之后，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，黏度上升，溶氧不足，酶活開始下降。

3.2 木質(zhì)層孔菌錳過氧化物酶酶學(xué)性質(zhì)

酶的溫度耐受性和其本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有很大關(guān)系，在不同溫度條件下酶反應(yīng)速率也大不相同。從試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際生產(chǎn)的角度考慮，52℃為木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的最適反應(yīng)溫度，此結(jié)果與吳會(huì)廣等[8]報(bào)道的錳過氧化物酶最適酶解溫度為55℃的結(jié)論基本相符。

金屬離子對(duì)酶的影響是多方面的，離子種類、離子電荷數(shù)、離子半徑大小以及離子濃度等，都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生不確定的影響。吳會(huì)廣[8]研究表明，鐵離子的濃度越低其抑制作用越小，本試驗(yàn)結(jié)果Fe2+的強(qiáng)抑制作用與所用濃度有很大關(guān)聯(lián)。金屬離子對(duì)酶的作用有兩種：一是作用酶的輔助因子，二是作為激活劑起作用，但是金屬離子與酶如何相互作用改變生物活性的分子機(jī)理仍然有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的最佳條件,即培養(yǎng)溫度35℃、碳源為小麥秸粉1.5 g/100 ml、氮源為胰蛋白胨0.5 g/100 ml、最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d。通過對(duì)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,最高酶活力可達(dá)1 180.3 U/l，這比優(yōu)化前的木質(zhì)層孔菌錳過氧化物酶產(chǎn)量提高了5.5倍。

酶作用特性研究結(jié)果顯示，木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的最適反應(yīng)溫度為52℃；最佳pH值范圍在4～5之間；在金屬離子的影響條件下，Zn2+和Ca2+對(duì)MnP的活力有促進(jìn)作用；Mg2+對(duì)MnP的活力影響不是很大；Cu2+、Fe2+和Ag+可使錳過氧化物酶的相對(duì)活性下降，具有對(duì)錳過氧化物酶活性的抑制作用，其中Fe2+的抑制作用最強(qiáng)。

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