三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條的研制

龔云飛，陳宗倫，奚茜，李沐潔，王唯芬，王旻子，應(yīng)永飛，張明洲

1 中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018

2 杭州迪恩科技有限公司，浙江 杭州 310013

3 浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，浙江 杭州 310020

三聚氰胺 (Melamine) 是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化工原料，廣泛應(yīng)用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣等行業(yè)[1]。三聚氰胺含氮量極高，不法商販把廉價的三聚氰胺添加入食品中，以虛假提高食品中的蛋白質(zhì)含量。2007年3月，美國發(fā)生4 000多起貓狗中毒死亡事件[2]；2008年我國爆發(fā)三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導(dǎo)致食用了受污染奶粉的嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥甚至死亡；2010年初再度爆發(fā)的問題奶粉事件，其原因都是奶粉中含有三聚氰胺[3]，因此開展對食品及飼料中三聚氰胺殘留的檢測勢在必行。目前，各國政府都禁止三聚氰胺用于食品生產(chǎn)，并規(guī)定了其在食品的最低限量值。三聚氰胺的檢測方法主要有高效液相色譜法 (HPLC)[4-6]、氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法 (GC-MS)[7]，液-質(zhì)聯(lián)用色譜法[6,8-10]和酶聯(lián)免疫吸附法[11-15]。

膠體金免疫層析技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法等免疫分析技術(shù)近年來在生物各領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用。目前，已報道的酶聯(lián)免疫吸附法對實際樣品中三聚氰胺的檢測限在1.8~20 mg/L，已能滿足各種食品或飼料的檢測要求。膠體金免疫層析法 (GICA) 是近10年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，它是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，用膠體金作為標記物。該方法操作簡單、快速、特異靈敏，不需要儀器，不需專業(yè)技術(shù)人員操作，幾分鐘內(nèi)即可通過目視判斷檢測結(jié)果，并可保持檢測結(jié)果，比酶聯(lián)免疫吸附法操作更簡單，更適合在現(xiàn)場應(yīng)用。因此在食品安全及醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[16-19]。本試驗制備的三聚氰胺膠體金檢測試紙條，為食品中三聚氰胺殘留水平監(jiān)測提供了便捷的方法，該試紙條具有較高的特異性、敏感性，而且操作簡單，具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

三聚氰胺 (純度98.5%) 購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；羊抗鼠IgG、氯金酸和檸檬酸三鈉購自 Sigma公司；硝酸纖維素膜 (簡稱 NC膜)分別購自Sartorius公司 (CN140)、Millipore公司 (M135) 和 Whatman公司 (Puraband impuraband)；玻璃纖維素膜購自Millipore公司；PVC底板、W-8濾紙與 MF-11吸水紙購自Whatman公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。三聚氰胺單克隆抗體 (1B12，IC50=8.3 mg/L) 和包被抗原MEL-OVA本實驗室制備[20-21]。

純牛奶 (伊利)、脫脂奶粉 (伊利) 與寵物飼料樣品 (均經(jīng)HPLC檢測，為陰性)，均購自杭州下沙物美超市。試驗中簡稱為牛奶、奶粉和飼料。

1.2 主要儀器

ARISTA-Q5切割機和ARISTA-XZ100平臺系統(tǒng)，均購自美國 Arista公司；恒溫干燥箱DHG-9146A，購自上海秦邁儀器有限公司；除濕機購自日本川井公司；紫外可見分光光譜儀，Shimadzu UV-2501PC；三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters Alliance 2695。

1.3 膠體金的制備與鑒定

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液：取0.01%氯化金溶液100 mL攪拌加熱至沸騰，迅速加入2.5 mL 1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌煮沸20 min，直至溶液呈透亮狀，停止加熱；室溫冷卻，用超純水恢復(fù)到原體積，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

膠體金質(zhì)量采用紫外掃描鑒定：膠體金溶液進行400~600 nm紫外掃描，觀察最大吸收峰的峰形和峰寬。

1.4 膠體金標記抗體的制備與鑒定

室溫下，將10 mL用0.1 mol/L K2CO3調(diào)pH為8.2的膠體金溶液加入50 mL燒杯中，邊攪拌邊逐滴加入 2 mL用 0.01 mol/L PBS稀釋為0.1 g/L的純化三聚氰胺單克隆抗體 (1B12) 溶液；繼續(xù)攪拌標記反應(yīng)10 min后，逐滴加入2 mL 5% BSA溶液，繼續(xù)攪拌10 min。采用高速離心法純化金標抗體，將上述金標抗體溶液常溫低速(1 831′g離心20 min，棄沉淀，取紅色上清夜4 ℃下10 989′g離心40 min；將中層可流動的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，用含 1% BSA的0.01 mol/L的PBS混懸至原量；平衡過夜，4 ℃下10 989′g離心40 min，中層可流動的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，用含1% BSA與0.02% NaN3的0.01 mol/L的PBS混懸為原體積的1/10~1/40，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用紫外掃描對金標抗體質(zhì)量進行鑒定，400~600 nm紫外掃描，通過觀察最大吸收峰的峰形和峰寬的完整性來判斷金標抗體質(zhì)量的好壞。

1.5 NC膜的選擇

選擇了 Sartorius、Millipore和 Whatman三種 NC膜進行包被抗原 MEL-OVA (檢測線，1 000 mg/L) 和羊抗鼠IgG (質(zhì)控線，1 000 mg/L)的包被試驗，用PBS及其添加100 mg/L、200 mg/L三聚氰胺標準品的樣品進行測試，選擇出線快、清晰與靈敏度達到要求的NC膜進行后續(xù)試驗。

1.6 膠體金標記抗體噴膜量、包被抗原包被量的選擇

1.6.1 膠體金標記抗體噴膜量的選擇

制備的膠體金標記 MEL單克隆抗體 1B12 mAb用0.01 mol/L的PBS稀釋10倍后，分別按每1 cm2玻璃纖維素膜噴涂20 μL、40 μL和60 μL體積進行噴膜，干燥后分別組裝試紙條；用PBS及其添加50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L三聚氰胺標準品的樣品稀釋液進行測試，選擇最佳噴膜量。

1.6.2 NC膜包被抗原包被量的選擇

包被抗原MEL-OVA稀釋成1 500 mg/L、1 200 mg/L和1 000 mg/L分別在NC膜檢測線上劃線，質(zhì)控線上均用1 000 mg/L的羊抗鼠IgG進行劃線，干燥后分別組裝試紙條；用樣品稀釋液及其添加50 mg/L、100 mg/L三聚氰胺標準品的樣品稀釋液進行測試。

1.7 樣品墊前處理試驗

采用0.01 mol/L PBS (pH 7.0)、0.01 mol/L PBS (pH 7.5)、0.01 mol/L TBS (pH 8.5) 對樣品墊進行前處理，組裝試紙條，分別用pH值約為7.0陰性液體純牛奶樣品及其添加50 mg/L、100 mg/L三聚氰胺標準品的樣品進行測試，選擇樣品墊最佳處理方式。

1.8 試紙條組裝與測試

1.8.1 試紙條制備與組裝

用ARISTA-XZ1000平臺系統(tǒng)在NC膜檢測線與質(zhì)控線分別噴上最佳包被量的包被抗原MEL-OVA與1 000 μg/mL的羊抗鼠IgG，在玻璃纖維素膜噴上最佳噴金量的膠體金標記MEL單克隆抗體1B12；NC膜和玻璃纖維素膜于烘箱中37 ℃干燥24 h，均置于干燥的容器中存放備用。依次搭接地粘貼吸水紙、樣本墊、玻璃纖維素膜和NC膜于PVC粘性底板上，ARISTA試紙條切刀機切割成一定尺度的試紙條，裝入檢測卡中，再裝入一袋干燥劑、封口，室溫保存。如圖1為試紙條組裝模式圖。

圖1 試紙條組裝模式圖Fig. 1 Cross-section of immunochromatographic strip.

1.8.2 最低檢測限測試

PBS中分別添加0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的三聚氰胺標準品，以PBS為對照，分別用優(yōu)化條件制備的試紙條進行測試，共對3個批次進行2個重復(fù)試驗。

1.8.3 實際樣品添加測試

陰性樣品中添加三聚氰胺標準品，采用組裝的試紙條進行測試。1) 牛奶樣品：直接添加三聚氰胺標準液到陰性純牛奶中，使三聚氰胺的添加濃度依次為：0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L；2) 奶粉：先將奶粉溶于水中，再添加三聚氰胺標準液于奶粉溶液中，使三聚氰胺的添加濃度依次為：0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L；3) 飼料：先將飼料溶于水中，再添加三聚氰胺標準液于飼料溶液中，使三聚氰胺的添加濃度依次為：0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L。

1.8.4 與LC-MS/MS比對試驗

1) 液相色譜條件：色譜柱：Waters xBridge HILIC 柱 (4.6 mm×150 mm，i.d.，3.5 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：20 mmol/L 甲酸銨：乙腈=8：2。

2) 質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源 (ESI)，正離子模式采集，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑溫度為350 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣為N2，脫溶劑流速為600 L/h，光電倍增器電壓為650 V，毛細管電壓為3.0 kV，萃取電壓為2.0 V；碰撞氣為高純氬氣，碰撞室壓為3×105Pa；監(jiān)測模式采用MRM 多反應(yīng)監(jiān)測方式，離子對為 m/z：127.2/85.1、127.2/68.1，其中m/z =127.2/85.1為定量離子對，離子對駐留時間為100 ms。

3) 樣品處理：精確量取或稱取試樣2 mL或2 g于50 mL離心管，加入19 mL水-乙腈 (1:1，V/V) 和1 mL飽和乙酸鉛溶液，混勻超聲波提取15 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL并加入0.2 mL甲酸充分混勻后過MCX固相萃取小柱，用6 mL乙腈淋洗，5 mL 5%氨水/甲醇溶液洗脫，60 ℃下氮氣吹干，用0.1 mL 20 mmol/L乙酸銨溶液溶解后，加入0.9 mL乙腈充分混勻后，過0.22 μm濾膜后上機測定。

陰性牛奶與奶粉樣品中添加三聚氰胺標準品，使?jié)舛冗_到w1mg/L (w1=50+10 n，n=0,1,2, 3….)，陰性飼料樣品中添加三聚氰胺標準品，使?jié)舛冗_到w2mg/L (w2=100+20 n，n=0,1,2,3….)，分別用 LC-MS/MS法和本研究的試紙條對每個濃度的樣品測試5次。

1.9 保存期加速試驗

將制作好的三聚氰胺試紙條每5條裝入1包鋁箔袋中，加干燥劑密封，放置60 ℃烘箱中，每隔1天取出1包 (5條) 分別用3個陰性樣本和2個陽性樣本 (添加200 mg/L、400 mg/L三聚氰胺標準品的樣本) 進行測試進行試紙條保存期試驗，觀察檢測線的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金質(zhì)量的鑒定

采用紫外掃描鑒定，膠體金溶液進行400~600 nm紫外掃描，觀察最大吸收峰的峰形和峰寬。從圖2可看出，A1與A2瓶膠體金溶液質(zhì)量比A3、A4好，計算出A1-A4的膠體金金顆粒直徑分別約為15、40、60、80 nm。以下試驗采用A2膠體金進行。

圖2 制備的膠體金溶液實物圖及紫外掃描圖Fig.2 Exterior appearance and UV absorbance spectra of colloidal gold solution. (A) Preparation of colloidal gold solution. 1: 1.0 mL; 2: 1.5 mL; 3: 2.0 mL; 4: 2.5 mL. (B) The UV absorbance spectra of different colloidal golds. A1: 519.20 nm; A2: 525.00 nm; A3: 539.40 nm; A4: 594.80 nm.

2.2 膠體金標記MEL單克隆抗體質(zhì)量的鑒定

從圖3可看出，獲得的金標抗體用0.01 mol/L的PBS稀釋50倍后進行紫外掃描，最大吸收峰具有很好的峰形和峰寬，說明標記的膠體金抗體顆粒大小適中且均一，表示金標抗體質(zhì)量好，可用于后續(xù)研究。

2.3 NC膜的選擇

選擇了Sartorius、Millipore和Whatman三種 NC膜進行包被抗原 MEL-OVA (檢測線，1 000 μg/mL) 和 羊 抗 鼠 IgG (質(zhì) 控 線 ，1 000 μg/mL) 的包被試驗，用PBS及其添加100、200 ng/mL三聚氰胺標準品的樣品進行測試，結(jié)果如圖4。綜合考慮膜的層析速度、檢測線與質(zhì)控線的顯色情況、最低檢測限與成本等因素，選擇Whatman的NC膜。

2.4 膠體金標記抗體噴膜量的選擇

制備的膠體金標記MEL抗體用0.01 mol/L的PBS稀釋10倍后，分別按每1 cm2玻璃纖維素膜噴涂20、40、60 μL體積進行噴膜，干燥后分別組裝試紙條；用樣品稀釋液及其添加50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L三聚氰胺標準品的PBS進行測試。從圖5可看出，噴膜量為60 μL/cm2效果最佳。

圖3 金標MEL抗體紫外掃描圖Fig.3 UV absorbance spectra of gold-antibody.

圖4 不同NC膜制作的試紙條效果圖Fig.4 The graph of strip produced by different NC membranes. (A) 0 mg/L (PBS). (B) 100 mg/L. (C) 200 mg/L. 1,2: Millipore NC membranes; 3,4: Whatman NC membranes; 5,6: Sartorius NC membranes. Amount added: C: control line; T: detection line.

2.5 NC膜包被抗原包被量的選擇

包被抗原MEL-OVA稀釋成1 500 mg/L、1 200 mg/L和1 000 mg/L分別在NC膜檢測線上劃線，質(zhì)控線上均用1000 μg/mL的羊抗鼠IgG進行劃線，干燥后分別組裝試紙條；用樣品稀釋液及其添加50 mg/L、100 mg/L三聚氰胺標準品的樣品稀釋液進行測試。從圖6可看出，包被抗原MEL-OVA為1200 mg/L時效果最佳。

圖5 不同膠體金標記抗體噴膜量試紙條效果圖Fig.5 The graph of strip produced by different gold-antibodies. (A) PBS. (B) 50 mg/L. (C) 100 mg/L. (D) 150 mg/L. 1: 60 μL/cm2; 2: 40 μL/cm2; 3: 20 μL/cm2.

圖6 不同包被抗原包被量試紙條效果圖Fig.6 Graph of strip produced by different volumes of coating antigen. (A) PBS. (B) 50 mg/L. (C) 100 mg/L. 1: 1 500 mg/L; 2: 1 200 mg/L; 3: 1 000 mg/L.

2.6 樣品墊前處理的選擇

采用0.01 mol/L PBS (pH 7.0)、0.01 mol/L PBS (pH 7.5)、0.01 mol/L TBS (pH 8.5) 對樣品墊進行前處理，組裝試紙條，分別用pH值約為7.0陰性液體純牛奶樣品及其添加 50 ng/mL、100 ng/mL三聚氰胺標準品的樣品進行測試。結(jié)果表明用0.01mol/L PBS (pH 7.5) 進行樣品墊前處理具有較好的效果，對金標記物與抗原/抗體的結(jié)合起穩(wěn)定的作用，同時也改變樣品 pH值是整個系統(tǒng)達到穩(wěn)定；同時可以使最低檢測限得到優(yōu)化 (圖7)。

2.7 試紙條組裝與測試

在上述研究基礎(chǔ)上，確定三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條的研制材料選擇及工藝參數(shù)選擇如下：NC膜，Whatman；膠體金標記三聚氰胺單克隆抗體噴膜量為 60 μL/cm2；包被抗原MEL-OVA包被量為1200 mg/L；二抗 (質(zhì)控線)包被量為1 000 mg/L；0.01 mol/L PBS (pH 7.5)進行樣品墊前處理。按此參數(shù)生產(chǎn)一批試紙條，進行檢出限、實際樣品加標、比對測試與保存期試驗。

圖7 樣品墊前處理試驗Fig.7 The test of sample pad pre-treatment. (A) PBS. (B) 50 mg/L. (C) 100 mg/L. 1: treatment by 0.01 mol/L PBS (pH 7.0); 2: treatment by 0.01 mol/L PBS (pH 7.5); 3: treatment by 0.01 mol/L TBS (pH 8.5); 4: no treatment.

2.7.1 最低檢測限試驗

試驗結(jié)果如圖8所示，隨著MEL添加濃度的增大，檢測線的顏色逐漸變淡，直至消失，在MEL添加濃度為50 mg/L時，檢測線已經(jīng)很難辨別，表明試紙條對三聚氰胺的最低檢測限可達到

50 mg/L。

2.7.2 實際樣本檢測試驗

HPLC檢測陰性牛奶、奶粉與飼料樣品中添加三聚氰胺標準品，采用組裝的試紙條進行測試。由圖9可見，試紙條在牛奶、奶粉和飼料中的肉眼可視最低檢測限分別為 100 mg/L、100 ng/g和200 ng/g。

圖8 MEL膠體金試紙條最低檢測限圖Fig.8 LOD of test trip for detecting melamine.

圖9 膠體金試紙條法測定牛奶、奶粉和飼料中的三聚氰胺Fig.9 The result of detecting melamine in milk, milk powder and feed. (A) Milk, melamine concentration (mg/L): 0, 50, 100 and 200. (B) Milk powder, melamine concentration (ng/g): 0, 50, 100 and 200. (C) Feed, melamine concentration (ng/g): 0, 100, 200 and 500.

2.7.3 LC-MS/MS法與CGIA檢測牛奶中三聚氰胺含量的比對

分別應(yīng)用兩種方法對不同濃度的樣品測試5次，主要結(jié)果見表1。牛奶與奶粉樣品中的MEL添加量為50 ng/g時，LC-MS/MS法能檢出，且回收率良好，而試紙條對牛奶與奶粉樣品中的MEL肉眼可視最低檢測限為 100 ng/g，不能檢出；牛奶與奶粉樣品中的MEL添加量不小于為100 ng/g時，LC-MS/MS法和試紙條均能檢出。而飼料樣品中的 MEL添加量為 100 ng/g時，LC-MS/MS法能檢出，且回收率良好，而試紙條對飼料樣品中的 MEL肉眼可視最低檢測限為200 ng/g，不能檢出；添加量不小于200 ng/g時，LC-MS/MS法和試紙條均能檢出。此結(jié)果表明，試紙條檢測結(jié)果與 LC-MS/MS法具有很高的符合率。

表1 LC-MS/MS法和金標法檢測MEL的對比試驗 (n=5)Table 1 The comparison test of melamine by LC-MS/MS and ICA (n=5)

2.7.4 試紙條保存期測試

保存期加速實驗結(jié)果如表2所示，表明60 ℃條件下可保存12 d。根據(jù)試紙條保存期經(jīng)驗：膠體金免疫層析試紙條60 ℃下穩(wěn)定1 d，相當于常溫干燥環(huán)境下可保質(zhì)1個月?？赏普?，三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條常溫干燥環(huán)境下至少可保質(zhì)6個月。

表2 三聚氰胺試紙條保質(zhì)期實驗Table 2 Experiment of shelf life for melamine test strip

3 結(jié)論

基于抗原抗體結(jié)合原理的免疫分析技術(shù)以其特異、便捷、快速的優(yōu)點，在小分子有害殘留監(jiān)測中被廣泛應(yīng)用。目前針對三聚氰胺的免疫分析技術(shù)也有報道，主要為酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法。其中介紹三聚氰胺的 ELISA檢測法主要為論文，研制方法詳盡；介紹三聚氰胺膠體金免疫層析法主要為專利[22-24]，還處于知識產(chǎn)權(quán)保護中。

在本研究中，詳細介紹了MEL膠體金免疫層析檢測試紙條的研制過程：NC膜、金標三聚氰胺抗體噴膜量、包被抗原 (檢測線) MEL-OVA包被量和二抗 (質(zhì)控線) 包被量的工藝參數(shù)為：硝酸纖維素膜采用Whatman NC膜、膠體金標記MEL單克隆抗體最佳噴膜量為60 μL/cm2、包被抗原MEL-OVA最佳包被量為1200 mg/L、樣品墊采用0.01 mol/L PBS (pH 7.5) 進行前處理。三聚氰胺膠體金試紙條肉眼可視最低檢測限為50 mg/L；試紙條在牛奶、奶粉和飼料中的肉眼可視最低檢測限分別為 100 mg/L、100 ng/g和200 ng/g，與LC-MS/MS法比對，具有較高的準確性；試紙條常溫干燥環(huán)境下可保質(zhì)6個月。能夠檢測出三聚氰胺含量大于50 mg/L的樣品，適用于現(xiàn)場實際樣品三聚氰胺殘留水平監(jiān)測，為三聚氰胺膠體金免疫層析檢測試紙條的研制及產(chǎn)品化提供了參考，具有良好的應(yīng)用前景。

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