評(píng)價(jià)新型穩(wěn)定同位素賴(lài)氨酸標(biāo)記在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

高東梅，孫璐，郭坤，李巖，劉銀坤，康曉楠

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，精確測(cè)量生物體所有蛋白質(zhì)在不同狀態(tài)下表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于探索蛋白質(zhì)生物功能，發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志物，尋找藥物靶標(biāo)等都具有十分重要的意義，蛋白質(zhì)組定量研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要前沿和方向[1]。目前定量蛋白質(zhì)組研究建立和發(fā)展的技術(shù)平臺(tái)主要有雙向熒光差異凝膠電泳 (Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)[2]、抗體芯片技術(shù)[3]及基于同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析技術(shù)[4]等。2D-DIGE因電泳技術(shù)固有的缺點(diǎn)，對(duì)低豐度蛋白質(zhì)、疏水性蛋白質(zhì)等難以進(jìn)行有效的分離分析，且操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，限制了其在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用?？贵w芯片技術(shù)操作簡(jiǎn)便，但是單克隆抗體的種類(lèi)有限限制了芯片的廣泛使用。

基于同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析技術(shù)是以穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo)，將物理化學(xué)性質(zhì)相同、質(zhì)量不同的同位素?fù)饺氲絻煞N樣品，混合后不同狀態(tài)的相同蛋白質(zhì) (肽) 因質(zhì)量差異在質(zhì)譜圖中表現(xiàn)為一對(duì)同位素峰，通過(guò)比較同位素峰的相對(duì)豐度，精確定量出蛋白質(zhì)不同狀態(tài)下表達(dá)量的變化，這種方法突破了前兩種技術(shù)局限性并顯示出可同時(shí)精確定量和鑒定的能力，成為當(dāng)今定量蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的主要發(fā)展方向，其中化學(xué)性標(biāo)記方法應(yīng)用最為廣泛[5-7]。

目前常用的穩(wěn)定同位素化學(xué)標(biāo)記主要包括同位素編碼親和標(biāo)簽 (Isotope-coded affinity tags，ICAT) 技術(shù)及同位素標(biāo)簽相對(duì)和絕對(duì)定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技術(shù)[89]，ICAT技術(shù)只標(biāo)記含巰基的多肽和蛋白質(zhì)，覆蓋率低；而 iTRAQ高額的成本限制了使用的廣泛性。

2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑 (2-methoxy-4,5-dihydro-1H-imidazole，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1) 在一定條件下可以和賴(lài)氨酸的側(cè)鏈氨基發(fā)生反應(yīng)，生成相應(yīng)的衍生物。胰酶水解蛋白產(chǎn)生以賴(lài)氨酸為C-末端的肽段在MALDI-MS中被檢測(cè)的敏感性較低，而賴(lài)氨酸側(cè)鏈的氨基與2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑反應(yīng)后生成的衍生物不僅在MALDI-TOF-MS中電離能力增強(qiáng)，而且MS/MS圖譜裂解片段的覆蓋性也增多，有利于蛋白質(zhì)的鑒定和從頭測(cè)序 (De novo)。2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑 4,5位的 4個(gè)氫在合成時(shí)可以置換成為氘，從而組成一對(duì)質(zhì)量差為4的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物。本文主要研究這對(duì)標(biāo)記物在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

2-甲氧基-4,5-1氫-咪唑(D0 reagent)及其衍生物 (2-甲氧基-4,5-二氘-1氫-咪唑，D4 reagent)的合成由歐洲生物與化學(xué)研究所 (European Institute of Biology and Chemistry) 有機(jī)組合成并惠贈(zèng)。牛血清白蛋白 (BSA)，DTT，碘乙酰胺，測(cè)序級(jí)胰酶及Glu1-纖維蛋白肽B均為Sigma產(chǎn)品。所有溶劑均為HPLC級(jí)別。C18 Zip Tip為Millipore公 司 產(chǎn)品，MALDI-TOF-MS 和LC-ESI-MS均為 Waters公司產(chǎn)品，LC-ESI-MS采用CapLC系統(tǒng) (75 mm i.d. C18 column) 反相色譜柱末端連接納噴霧針。

1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品

牛血清白蛋白按1 g/L濃度溶解于25 mmol/L Tris (pH 8.3) 或者含8 mol/L尿素的25 mmol/L Tris (pH 8.3)，加入65 mmol/L DTT充分還原1 h；加入碘乙酰胺 (終濃度為100 mmol/L) 置于室溫暗處進(jìn)行烷基化。之后，樣本被 10倍稀釋?zhuān)ＷC稀釋后尿素濃度低于1 mol/L。加入測(cè)序級(jí)胰酶室溫孵育過(guò)夜。

1.3 標(biāo)記反應(yīng)

8支 BSA 酶解后的肽溶液，每份 10 μL (0.5 μmol/L) 與等體積的0.8 mol/L D0 reagent孵育，另外8支BSA酶解后的肽溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)組分別與等體積的0.8 mol/L D4 reagent孵育。反應(yīng)條件：55 ℃，3 h，然后加入1 μL三氟乙酸 (TFA) 終止反應(yīng)。D0衍生肽和D4衍生肽按比例 (從10:1到1:5) 混合，部分混合用C18 Zip Tip除鹽后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，另一部分直接進(jìn)行nano-LC-ESI-MS分析。

1.4 MALDI-TOF-MS分析

0.75 μL樣本與0.75 μL 2 g/L的α-氰基-4-羥基肉桂酸 (CHCA) 基質(zhì)溶液混合，點(diǎn)到樣本靶上，空氣干燥后送入質(zhì)譜檢測(cè)。儀器采用 PEG混合外標(biāo)校準(zhǔn) (包括PEG200，600，1 000和2 000以及NaI)，進(jìn)一步采用Glu1纖維蛋白肽B為內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)。在MALDI-TOF-MS陽(yáng)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析，加速電壓為20 kV，獲取質(zhì)量范圍在500~3 000 Da的譜圖。

1.5 LC-ESI-MS分析

HPLC微分析工作站與 ESI-MS的電噴霧接口相連。分析物送入樣本環(huán)，流動(dòng)相A液為0.2%甲酸，流動(dòng)相B液為0.2%甲酸和80%乙腈，線性梯度洗脫程序?yàn)椋?~5 min，0~56%流動(dòng)相B液；5~7 min為80%乙腈。氮?dú)庾鳛閲婌F氣體。譜圖以0.5 譜圖/s的速度獲得，陰離子數(shù)閾值為1。

1.6 反相液相色譜分離

HPLC連接ESI-MS觀察D0和D4標(biāo)記的BSA酶解肽在不同色譜峰中的比值，觀察D0和D4標(biāo)記肽在反相液相色譜中的分離是否有明顯差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑標(biāo)記賴(lài)氨酸反應(yīng)的特異性分析

用 2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑標(biāo)記賴(lài)氨酸側(cè)鏈，觀察其反應(yīng)的特異性以及對(duì)MALDI電離的影響。圖1顯示了賴(lài)氨酸側(cè)鏈與標(biāo)記物的反應(yīng)。圖2顯示牛血清白蛋白的胰酶水解肽分別與D0試劑衍生反應(yīng)前后的MALDI質(zhì)譜圖。與未衍生的形式比較，衍生之后可以檢測(cè)到更多含有賴(lài)氨酸的肽。

表1顯示的是MALDI質(zhì)譜圖中各峰值，D0標(biāo)記后含有賴(lài)氨酸的肽段與原先的肽段相差68 Da或者68 Da的整數(shù)倍，這取決于肽段上賴(lài)氨酸的數(shù)目，而D4標(biāo)記后含有賴(lài)氨酸的肽段與原先的肽段相差72 Da或者72 Da的整數(shù)倍。不含賴(lài)氨酸的肽段質(zhì)量數(shù)不變，說(shuō)明衍生反應(yīng)不發(fā)生在肽段的N-末端。從ESI MS圖譜上，肽段之間差異的M/Z比取決于帶H+的數(shù)量，一般為2.0或4.0 (表2)。Peptide1和Peptide9都含有2個(gè)賴(lài)氨酸，但是Peptide1只有1個(gè)賴(lài)氨酸被標(biāo)記，可能由于2個(gè)賴(lài)氨酸距離較近，標(biāo)記物不容易靠近。

圖1 2-甲基-4,5-2氫-1氫咪唑 (D0型) 與賴(lài)氨酸的反應(yīng)Fig.1 Modification of lysine residues with 2-methoxy-4,5-dihydro-1H-imidazole.

圖2 牛血清白蛋白胰酶水解肽與2-甲基-4,5-2氫-1氫咪唑反應(yīng)前后MALDI-MS圖譜的變化Fig.2 MALDI-MS analysis of BSA tryptic peptides labelled with 2-methoxy-4,5-dihydro-1H-imidazole. (A) No derivatization. (B) After derivatization. K: lysine; K*: lysine labelled with 2-methoxy-4,5-dihydro-1H-imidazole.

表1 BSA酶解肽經(jīng)過(guò)D0和D4標(biāo)記后在MALDI中的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Summary of D0- and D4- derivative mixture of BSA tryptic peptide detected by MALDI

表2 BSA酶解肽經(jīng)過(guò)D0和D4標(biāo)記后在ESI中的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Summary of D0- and D4- derivative mixture of BSA tryptic peptide detected by ESI

2.2 相對(duì)定量方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性

為了觀察該標(biāo)記反應(yīng)用于定量的準(zhǔn)確性，我們使用 BSA胰酶水解物作為標(biāo)準(zhǔn)品分別用D0和 D4標(biāo)記，然后進(jìn)行MALDI-TOF-MS和LC-ESI-MS分析。

在MALDI分析中，按照從10∶1到1∶5不同的摩爾比混合D0和D4標(biāo)記肽，選擇肽段LVNELTEFAK (圖3中的Peak1231和Peak1235)作為代表峰觀察定量方法的準(zhǔn)確性：MALDI-TOF-MS圖中同位素對(duì)峰的強(qiáng)度比值反映了真實(shí)的濃度比。圖3顯示同位素標(biāo)記的肽段強(qiáng)度比值與原始的濃度比完全一致，同位素標(biāo)記峰質(zhì)量相差4 Da，表明存在單一標(biāo)記，減去標(biāo)記的質(zhì)量數(shù)，這個(gè)峰被鑒定為表1中的Peptide5和Peptide6。

D0標(biāo)記和D4標(biāo)記的BSA酶解肽分別按照1∶1，1∶2，1∶3和 1∶5的比例混合后送入LC-ESI-MS檢測(cè)。圖 4顯示混合比例的結(jié)果與MALDI-TOF-MS的結(jié)果幾乎一致。在每張譜圖上可以發(fā)現(xiàn)至少4對(duì)比值相同的穩(wěn)定同位素標(biāo)記峰。MALDI和ESI兩種電離方式得到一致的定量結(jié)果。

圖3 D0和D4標(biāo)記的BSA酶解肽以不同濃度混合后的MALDI-MS圖譜Fig. 3 MALDI spectrum showed the ratio of D0-labeled and D4-labeled BSA tryptic peptides. The serial ratio is from 10:1 to 1:5, the D0-labeled peptide loaded on each target is 125 fmol. The paired peaks 1 231 and 1 235 were showed.

圖4 D0和D4標(biāo)記的BSA酶解肽以不同濃度混合后的ESI-MS圖譜Fig. 4 ESI-mass full scan showed labeled BSA peptides with serial ratio 1:1, 1:2, 1:3, 1:5 from top to bottom.

分別以 D0標(biāo)記物和 D4標(biāo)記物的理論混合比作為橫坐標(biāo)，實(shí)際測(cè)得的豐度比作為縱坐標(biāo)，作線性關(guān)系圖，得到測(cè)量準(zhǔn)確性的相關(guān)系數(shù)R = 0.9999，見(jiàn)圖5。每次混合都做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn) (n=3)，計(jì)算其定量的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，Peptide5和Peptide6在不同比例下的平均標(biāo)準(zhǔn)差為 0.06，變異系數(shù)為 3.9%，說(shuō)明該方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

2.3 衍生物的串聯(lián)質(zhì)譜 (Tandem-MS) 圖特點(diǎn)

肽經(jīng)過(guò)衍生之后或者帶電荷或者質(zhì)子親和性增強(qiáng)[10-11]。因此我們觀察標(biāo)記后是否對(duì)肽的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記后的MALDI-MS/MS圖譜主要以y離子為主，非常有利于譜圖的解析，測(cè)序更為簡(jiǎn)便 (圖6)。在ESI電離模式下，ESI-MS生成雙電荷離子峰，ESI-MS/MS也是以y離子為主。

圖5 D0和D4標(biāo)記肽的理論濃度比值和MALDI-MS實(shí)際檢測(cè)比值的線性關(guān)系Fig. 5 Linear relationship between theoretical ratio and measured ratio in MALDI-MS.

圖6 標(biāo)記后的酶解肽MALDI-TOF-MS/MS圖譜以y離子峰為主Fig. 6 MALDI-MS/MS fragmentation of a labeled tryptic peptide. In this ionisation mode, fragments belonging to the y ions series are dominant.

2.4 標(biāo)記反應(yīng)對(duì)反相色譜行為的影響

圖7顯示了經(jīng)過(guò)RPLC之后D0和D4標(biāo)記肽分離沒(méi)有差異，在連續(xù)掃描下，D0和D4同位素對(duì)的比值可以保持一致，從而確定了該標(biāo)記方法可以用于基于液質(zhì)聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)在MALDI-TOF-MS中含精氨酸的肽比含賴(lài)氨酸的肽更容易電離，信號(hào)可增強(qiáng)4~18倍，原因是精氨酸的堿性比賴(lài)氨酸要強(qiáng)[12-14]，從理論上說(shuō)如果增強(qiáng)賴(lài)氨酸的堿性將有助于增加其電離能力[15-16]。因此通過(guò)2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑修飾賴(lài)氨酸側(cè)鏈可以增加其堿性改善其電離能力。該標(biāo)記試劑高度水溶，易于溶解于目的肽溶液，產(chǎn)生的化合物在結(jié)構(gòu)上與胍類(lèi)似，可增加肽指紋圖譜的覆蓋性。我們的標(biāo)記方法是針對(duì)賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基。Regnier實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)分別被1H和2H穩(wěn)定同位素試劑標(biāo)記的肽段在反相液相色譜中的保留時(shí)間不一致[17]，2H穩(wěn)定同位素試劑所標(biāo)記的肽段在反相液相色譜中較早流出，隨著試劑中的2H原子數(shù)量的增加，1H和2H標(biāo)記的肽段在反相液相色譜中會(huì)完全分離，如果輕型和重型標(biāo)記物標(biāo)記的同一肽段在反相液相色譜中的分離效果不同，這會(huì)產(chǎn)生最嚴(yán)重的問(wèn)題，即在同一色譜峰中一對(duì)標(biāo)記肽的峰度比值會(huì)不同，從而很難判斷哪個(gè)比值是分析物真正的比值。因此我們觀察了標(biāo)記肽在RPLC中的分離情況。實(shí)驗(yàn)證明，氘原子的引入不會(huì)影響到標(biāo)記保留時(shí)間，D0和D4衍生物具有相同的保留時(shí)間，反相液相色譜中可以保持較好的分離效果，差異表達(dá)蛋白的定量可以通過(guò)MALDI和ESI電離模式實(shí)現(xiàn)。由于二次電離以產(chǎn)生y離子為主，所以標(biāo)記肽的測(cè)序更為簡(jiǎn)便。

圖7 混合標(biāo)記酶解肽混合物液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用離子流圖譜Fig. 7 Ion currency chromatography of labeled tryptic peptide mix in LC-ESI-MS. D0 and D4-peptides have same separation during the process, the ratio was kept identical. (A) The total ion currency chromatography oflabeled tryptic peptide mix in LC-ESI-MS. (B) The combining mass spectrum from scan 778 to 795. (C) The mass spectrum of scan 778. (D) The mass spectrum of scan 784. (E) The mass spectrum of scan 790.

致謝：感謝法國(guó)歐洲生物與化學(xué)研究所Prof.Jean Marrie Schmitter的協(xié)助和支持。

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